紫米蛋白-多酚复合物的结构组成及分子形貌

梁 征，熊思慧，郭 莹，刘 刚，黄庆荣，何静仁

（武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023）

紫米蛋白-多酚复合物的结构组成及分子形貌

梁 征，熊思慧，郭 莹，刘 刚，黄庆荣，何静仁*

（武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023）

为研究紫米中蛋白-多酚复合物的分离纯化及其结构组成与分子形貌，采取Osborne分级提取从紫米中得到紫米蛋白-多酚复合物，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析其分子质量，邻苯二甲醛柱后衍生法分析比较紫米蛋白-多酚复合物以及大米蛋白的氨基酸组成，高效液相色谱-二极管阵列检测器-质谱联用技术分析鉴定紫米蛋白-多酚复合物中花色苷聚合物的基本单体组成，并利用原子力显微镜观察紫米蛋白-多酚复合物的表面形貌特征。结果表明，紫米蛋白-多酚复合物的蛋白质质量分数为（94.3±2.7）%，多酚含量为（10.1±4.0） mg/g；紫米蛋白-多酚复合物与大米蛋白在37 ku以上分子质量处亚基组成存在明显差异；复合物的氨基酸组成更加丰富，有更优的必需氨基酸组成；复合物中花色苷单体组成为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖苷；紫米蛋白-多酚复合物以不规则球形结构为主，其结合单元的粒径大约为4.7 nm左右。本实验对后续探索有色谷物多酚复合物的功能特性、多酚-蛋白质相互作用与生物活性等提供了科学依据。

紫米；蛋白-多酚复合物；结构组成；分子形貌；原子力显微镜

紫米，又称紫糯米，是一种天然“营养型”、“功能型”、“效益型”珍稀谷类[1-4]，是中国消费量最大的功能稻米。紫米有滋阴补肾、健脾暖肝、明目活血、抗癌和预防心脏病等作用[5-6]，在中国传统医学中被用于增强肾功能、防治贫血、促进血液循环、消除瘀血、防治糖尿病和改善视力。紫米防治慢性病功效显著，主要归结于紫米种皮中富含花色苷、总黄酮、咖啡酸和阿魏酸等多酚类成分以及膳食纤维、维生素和甾醇类功能成分，使得紫米越来越受到人们的青睐。

紫米富含蛋白质及花色苷类多酚物质，目前关于紫米蛋白及其理化性质研究的报道较少，特别是对其氨基酸组成、亚基组分及表面形貌的研究甚少。此外，有关紫米多酚类物质的研究主要集中在紫米中花色苷类成分的提取[7]及其提取物的抗癌、消炎、抗糖尿病、降血脂等生物活性方面，对蛋白质结合花色苷复合物的情况研究较少。紫米蛋白-多酚复合物作为一种天然的多酚与蛋白质的聚合物，在蛋白-多酚复合物的分离纯化中，多酚或花色苷聚合物与谷蛋白可能以共价键或非共价键的形式结合，因此本研究采取Osborne分级法提取紫米蛋白-花色苷类多酚复合物并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）、邻苯二甲醛（ortho phthalaldehyde，OPA）柱后衍生法分析、高效液相色谱-二极管阵列检测器-质谱（high performance liquid chromatography-diode array detector-mass spectrum，HPLC-DAD-MS）联用技术及原子力显微镜等研究紫米蛋白-多酚复合物的结构组成以及分子形貌，为探索有色谷物蛋白多酚复合物的功能特性、多酚-蛋白相互作用及其对生物活性的影响提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

墨江紫米（Oryza sativa L.） 云南墨江紫归牌；大米 市售（湖北产）；石油醚、乙醇（均为分析纯） 天津科密欧公司；氯化钠、盐酸、氢氧化钠（均为分析纯）上海国药化学试剂公司；甲酸、乙腈（均为色谱级）美国Tedia公司。

1.2 仪器与设备

AL204型电子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；STARER3100型电子pH计 美国Ohaus公司；YB-1000A型高速多功能粉碎机 永康市速锋工贸科技有限公司；TGL205型冷冻离心机 长沙平凡仪器仪表有限公司；ALPHA 2-4型冷冻干燥机 美国Christ公司；UDK 159型全自动微量凯氏定氮仪 意大利Velp Scientifica公司；垂直电泳仪、电泳成像设备 美国Bio-Rad公司；Accela LTQ XL HPLC-DAD-MS联用仪（配有DAD、ESI离子源及Xcalibur数据处理系统） 美国Thermo Fisher公司；原子力显微镜 美国Veeco Instruments公司。

1.3 方法

1.3.1 紫米蛋白-多酚复合物的提取

1.3.1.1 紫米的预处理及脱脂

参考李亦蔚[2]的方法，将墨江紫米经粉碎机磨成粉之后，过100 目筛。将紫米粉用石油醚超声脱脂3 次，每次超声30 min，直至石油醚呈无色透明为止。将脱脂后的紫米粉末置于通风处放置12 h以除去残余的石油醚。

1.3.1.2 Osborne分级法提取紫米蛋白-多酚复合物

取50 g脱脂紫米粉，加入500 mL蒸馏水，于室温条件下搅拌提取2 h后，以4 000 r/min的转速室温离心30 h。向离心所得到的沉淀物质里加入500 mL 5% NaCl溶液，于室温下搅拌提取2 h后，以4 000 r/min的转速室温离心30 min。然后向离心所得到的沉淀物质里加入500 mL 70%乙醇，于室温条件下搅拌提取2 h后，以4 000 r/min的转速室温离心30 min。对上述步骤离心所得到的沉淀物质进行水洗，直至没有乙醇残留后，向其加入500 mL 0.05 mol/L NaOH溶液，于室温条件下搅拌提取2 h后，以4 000 r/min的转速室温离心30 min，合并离心所得的上清液，向上清液中加入0.05 mol/L盐酸溶液，调节pH值至4.4。将上清液于室温条件下4 000 r/min离心30 min，收集紫米蛋白多酚复合物沉淀。用蒸馏水冲洗紫米蛋白多酚复合物沉淀，然后将其置于透析袋（截留分子质量3 500 u）中透析1 d。收集得到的紫米蛋白-多酚复合物，置于-20 ℃冰箱内冷冻，冷冻干燥成粉末，待后续检测。以上每次提取步骤重复2 次，并对大米进行相同的处理得到大米蛋白[8-9]。

1.3.2 紫米蛋白-多酚复合物的SDS-PAGE

紫米蛋白-多酚复合物的SDS-PAGE采用质量分数12%、pH 8.8的分离胶进行分离。紫米蛋白-多酚复合物和大米蛋白溶解于0.1 mol/L NaOH溶液中，蛋白质质量浓度为0.5 μg/μL，然后向其加入含有二硫苏糖醇和溴酚蓝指示剂的上样缓冲液，沸水浴5 min使蛋白质热变性。蛋白质的上样量为10 μL。蛋白质分子质量标准为10～100 ku。电泳的具体步骤为：首先用60 V电压电泳30 min，待指示剂条带处于浓缩胶和分离胶的交界处，然后使用120 V电压电泳，直至指示剂条带处于胶的底端时停止电泳。用考马斯亮蓝R250进行蛋白质染色，之后用洗脱液洗脱。洗脱完成后，用凝胶成像系统进行拍照。电泳的结果采用Quantity One 4.6.2版软件进行分析[10]。

1.3.3 紫米蛋白-多酚复合物的基本成分测定

采用全自动微量凯式定氮仪测定。每次测定取样品0.5 g，蛋白质转换系数取5.85。紫米蛋白-多酚复合物中水分和灰分测定分别依照GB 5009.3—2010《食品中水分的测定》[11]和GB 5009.4—2010《食品中灰分的测定》[12]。

1.3.4 紫米蛋白-多酚复合物中总多酚含量的测定

紫米蛋白-多酚复合物中总多酚的提取方法[13]为：取2 g冻干后的紫米蛋白-多酚复合物，用60 mL 4 mol/L NaOH溶液在室温条件下充氮气搅拌4 h，使其溶解充分。然后用6 mol/L盐酸酸化至pH 1.5～2.5，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相后，过无水硫酸钠除去水分后减压干燥，用80%乙醇定容至10 mL。

紫米蛋白-多酚复合物中总多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu法[13]：以没食子酸作对照，在10 mL的容量瓶中加入5 mL去离子水，再加0.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，摇匀1 min后再加入1.5 mL 20% Na2CO3溶液，最后加蒸馏水定容至10 mL，于室温孵化2 h。在760 nm波长处测定对照品溶液的吸光度。

1.3.5 紫米蛋白-多酚复合物和大米蛋白中氨基酸含量的测定

参考刘婷[14]、赵晶晶[15]等的方法 ，采用OPA柱后衍生法测定。

前处理过程：称量蛋白质粉末0.25 g溶解于4 mL甲醇，振荡30 min，放入-20℃的冰箱冷冻16 h。10 000 r/min离心20 min，取上清液3 mL，用氮气吹干，加入3 mL乙醇，振荡30 min，放入-20 ℃的冰箱冷冻10 h。10 000 r/min离心20 min，取上清液3 mL以氮气吹干后冻干，加入200 μL蒸馏水，振荡20 min，取出后10 000 r/min离心20 min，取上清液经过0.4 μm针头过滤器后待测。

液相色谱条件：7725I手动进样器、Waters 680梯度控制器、Pickering柱后衍生系统、离子交换树脂色谱柱（4.6 mm×150 mm）、Varian363荧光检测器；流动相：A：0.2 mol/L Na315试剂（pH 3.0）、B：0.2 mol/L Na740试剂（pH 9.8）、流速：0.4 mL/min；柱温：60 ℃；检测波长：激发波长338 nm、发射波长425 nm；进样量：氨基酸标准品2 μL、样品4 μL；衍生剂：OPA。

式中：m1为紫米蛋白-多酚聚合体中氨基酸含量/（mg/g）；m2为鸡蛋蛋白质中氨基酸含量/（mg/g）。必需氨基酸指数的计算方法为：紫米蛋白-多酚复合物中含有的必需氨基酸与鸡蛋蛋白质中必需氨基酸含量比值的几何平均数。

1.3.6 HPLC-DAD-MS测定紫米蛋白-多酚复合物中花色苷单体组成

取0.5 g紫米蛋白-多酚复合物溶解于25 mL 0.2 mol/L的盐酸溶液（pH 2.0）中，等体积乙酸乙酯振荡萃取，重复3 次，合并水相并浓缩。将浓缩液过80～100 目聚酰胺树脂，用70%乙醇洗脱花色苷。收集乙醇洗脱部分，减压浓缩并定容至5 mL，HPLC-DAD-MS分析其花色苷组成[16]。

色谱柱为Thermo C18反相柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm），柱温箱温度25 ℃，检测器使用DAD，检测波长530 nm，样品进样量10 μL。流动相的总流速为150 μL/min，流动相A为0.3%甲酸溶液，流动相B为甲酸-乙腈-水（0.3∶30∶69.7，V/V）。梯度洗脱的方法如下：0 min，30%B；30 min，90%B；32 min，90%B；35 min，30%B。MS条件如下：采用ESI离子源，毛细管温度270 ℃，毛细管电压26 V，N2流速20 L/min，离子扫描范围m/z 100～2 000 。整个过程采用正离子扫描模式[17-18]。

1.3.7 原子力显微镜观察紫米蛋白-多酚复合物表面形貌紫米蛋白-多酚复合物的表面形貌观察采用原子力显微镜的轻敲模式进行测定[19]。干燥的紫米蛋白-多酚聚合物用0.1 mol/L的NaOH溶液充分溶解，其中紫米蛋白多酚聚合物的质量浓度为0.1 mg/mL。测试前，将20 μL样品滴到硅片上，吸附30 s后，滴加1滴蒸馏水清洗硅片，用氮气吹干，反复2 次。拍摄尺寸选择2 μm×2 μm，使用Nanoscope 5.30分析软件处理图像。

2 结果与分析

2.1 紫米蛋白-多酚复合物的组成分析

采用Osborne分级提取干燥后的紫米蛋白-多酚复合物，其水分质量分数为（1.5±0.1）%，灰分质量分数为（2.2±0.7）%。通过微量凯氏定氮法测得其蛋白质质量分数为（94.3±2.7）%，Folin-Ciocalteu法测得其总酚含量为（10.1±4.0） mg/g。紫米蛋白-多酚复合物经Osborne分级提取的得率为10.4%。

2.2 紫米蛋白-多酚复合物的SDS-PAGE

图1 紫米蛋白-多酚复合物与大米蛋白SDS-PAGE图谱Fig. 1 SDS-PAGE of purple rice protein-polyphenol complexes and rice glutenin

在蛋白质标准分子质量范围10～100 ku内，用凝胶电泳分析软件Quantity One对条带分子质量进行分析，紫米蛋白-多酚复合物和大米蛋白有数条清晰的条带（图1）。首先，两种蛋白质均有分子质量相近的3条条带D、E、F。其中，D条带分子质量约为32～34 ku，E条带分子质量约为18～20 ku，F条带分子质量约为12～13 ku。这与Snow等[20]对大米蛋白多肽组成的研究相似：D条带为酸性α亚基，E条带为碱性β亚基，F条带为少量的醇溶蛋白。两种蛋白质有分子质量相似的亚基条带，说明紫米蛋白-多酚聚合物与大米蛋白质可能由相同的亚基组成。其次，紫米蛋白-多酚聚合物和大米蛋白在37 ku以上的分子质量区域有不同的条带分布：紫米蛋白-多酚聚合物有A、B、C 3条条带，分子质量分别为74～75、61～62、41～43 ku；而大米蛋白分子质量在37 ku以上有G、H两条条带，分子质量分别为62～64、39～40 ku。金融[21]、刘深勇[22]等的研究指出，大米蛋白亚基之间常由-S-S-装配成分子质量较大的高级结构，两种蛋白质在37 ku以上的分子质量区域条带的出现，可能是因为两个或多个亚基形成了复杂的蛋白质高级结构，导致分子质量有不同程度的增大。紫米蛋白-多酚聚合物和大米蛋白在37 ku以上的分子质量区域有不同的条带分布，说明两种蛋白高级结构具有差异，这可能导致两种蛋白质表现出不同的功能性质。

2.3 紫米蛋白-多酚复合物的氨基酸组成分析

表1 紫米蛋白-多酚复合物和大米蛋白中17 种氨基酸含量Table 1 Contents of 17 amino acids in purple rice protein-polyphenol complexes and rice glutenin g/100 g

由表1可知，紫米蛋白-多酚复合物相对于普通大米蛋白，苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸和精氨酸的含量均有所提高。蛋白中的第一限制氨基酸是赖氨酸，相比于大米蛋白，紫米蛋白-多酚复合物含有较多的赖氨酸。因此紫米蛋白-多酚复合物的氨基酸质量更优于普通的大米蛋白。

谷蛋白是大米主要蛋白质组分，通常表现出强烈的疏水性。蛋白质的疏水性与蛋白质一级结构中疏水性氨基酸的含量密切相关。由表1可知，紫米蛋白-多酚复合物组分中疏水性氨基酸质量百分比较高，达（35.8±0.3）%，约占总氨基酸的1/3。因此紫米蛋白-多酚复合物具有较强的疏水性能。

表2 紫米蛋白-多酚复合物及大米蛋白的必需氨基酸组成Table 2 Essential amino acids of purple rice protein-polyphenol complexes and rice protein g/100 g

表3 紫米蛋白-多酚复合物及大米蛋白氨基酸评分和必需氨基酸指数Table 3 Amino acid score(ASS) and essential amino acid index (EAAI) of purple rice protein-polyphenol complexes and rice?protein %

朱智伟等[23]的研究表明，米色不同的稻米蛋白质品质差异较大，其中紫黑色米的蛋白质营养价值最高。由表2可知，紫米蛋白-多酚复合物的必需氨基酸质量百分比较高，占总氨基酸的（35.1±0.9）%。与FAO/WHO推荐的优质蛋白质模式比较，紫米蛋白-多酚复合物的氨基酸组成中，除赖氨酸和异亮氨酸含量略有不足，亮氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸、苏氨酸含量明显较高，缬氨酸含量相当。而大米蛋白的必需氨基酸含量低于FAO/WHO推荐模式。必需氨基酸指数（essential amino acid indexes，EAAI）衡量了蛋白质的质量和利用率。EAAI指数越高表示蛋白质的质量越优质[24]。由表3可知，相比于普通的大米蛋白，紫米蛋白-多酚复合物的必需氨基酸指数的评分较高，具有更高的营养价值。

2.4 紫米蛋白-多酚复合物中花色苷组成分析

图2 紫米蛋白-多酚复合物中花色苷HPLC图Fig. 2 HPLC results for anthocyanins in purple rice protein-polyphenol complexes

紫米蛋白-多酚复合物中花色苷组成的HPLC分析结果（图2）表明，在530 nm波长处两个主要吸收峰，峰1和峰2的保留时间分别为13.62 min和17.92 min。HPLC-DAD-MS进一步分析鉴定其结构。如图3所示，峰1的一级质谱有449（[M+H]+）的特征离子峰，这与矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的分子质量吻合。该化合物的二级质谱图（图4）进一步表明，峰1特征离子峰在二级质谱中有287（[M+H-162]+）的特征碎片，这是矢车菊素单体失去一个葡萄糖分子（相对分子质量162）的特征离子峰[18]。因此紫米蛋白-多酚复合物中峰1为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷（图6）。峰2的一级质谱如图5所示，MS图中出现了463（[M+H]+）的特征离子峰，这与芍药素-3-O-葡萄糖苷的分子质量吻合，该化合物含量较低，二级质谱中没有出现明显碎片离子，进一步与黑米花色苷的有关文献[9,25]比较分析，推断该离子峰为芍药素-3-O-葡萄糖苷（图6）。

图3 峰1的一级质谱图Fig. 3 Full mass spectrum of peak 1

图4 峰1的二级质谱图Fig. 4 Secondary mass spectrum of peak 1

图5 峰2的一级质谱图Fig. 5 Full scan mass spectrum of peak 2

图6 矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖苷的结构式Fig. 6 Structure of cyanidin-3-O-glucoside and peonidin-3-O-glucoside

2.5 紫米蛋白-多酚复合物的表面形貌

图7 紫米蛋白-多酚复合物（0.1 mg/mL）的原子力显微镜成像结果Fig. 7 Tapping mode atomic force microscopy (AFM) images of purple rice protein-polyphenol complexes at concentration of 0.1 mg/mL

图80 .1 mg/mL紫米蛋白-多酚复合物原子力显微镜高度图选择分析Fig. 8 Sectional analysis of AMF height image of protein particles formed by 0.1 mg/mL purple rice protein-polyphenol complexes

原子力显微镜是表征蛋白质表面形貌特征的常用手段。在缓冲液体系中，常使用原子力显微镜的轻敲模式分析样品。本实验对质量浓度为0.1 mg/mL的紫米蛋白-多酚复合物在轻敲模式下进行原子力显微镜成像分析，得到高度图和相图（图7）。结果表明：紫米蛋白-多酚复合物分子呈现较为不规则的球形，可能是蛋白质之间、蛋白质与多酚之间以及蛋白质-多酚-蛋白质之间的多种聚合作用[26-27]产生。图8显示了紫米蛋白-多酚复合物在0.1 mg/mL下的测量尺寸，其中垂直距离指蛋白颗粒从顶端到底部的尺寸，通常反映蛋白颗粒在干燥状态下的粒径。如图8所示，0.1 mg/mL紫米蛋白-多酚复合物的垂直距离约为4.7 nm。

3 结 论

采用Osborne分级制备紫米蛋白-多酚复合物，其蛋白质质量分数为（94.3±2.7）%，多酚含量为（10.1±4.0） mg/g。SDS-PAGE分析表明，紫米蛋白-多酚复合物与大米蛋白在12～34 ku范围内有相同的3条亚基条带，但在37 ku以上分子质量处亚基组成存在明显差异。OPA柱后衍生法分析了紫米蛋白-多酚复合物和大米蛋白质的氨基酸组成，结果表明前者的氨基酸组成更加丰富，与FAO/WHO模式相比具有更优的必需氨基酸组成。HPLC-DAD-MS分析鉴定了紫米蛋白-多酚复合物中花色苷的单体组成，主要为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷和芍药素-3-O-葡萄糖苷。原子力显微镜观察了紫米蛋白-多酚复合物的分子形貌，在0.1 mg/mL质量浓度下蛋白粒径大约为4.7 nm，以不规则球形结构为主。通过实验得出紫米蛋白-多酚复合物的主要成分为紫米谷蛋白-花色苷复合物，紫米谷蛋白-花色苷复合物的结构组成及形貌的初步研究为后续探索有色谷物蛋白多酚复合物的功能特性、多酚-蛋白相互作用与生物活性及高蛋白、高花色苷含量紫米功能食品开发研究提供科学依据。

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Structural Composition and Molecular Morphology of Purple Rice Protein-Polyphenol Complexes

LIANG Zheng, XIONG Sihui, GUO Ying, LIU Gang, HUANG Qingrong, HE Jingren*
(College of Food Science and Engineering, Wuhan Polytechnic University, Wuhan 430023, China)

The present study investigated the separation and purification of purple rice protein-polyphenol complexes as well as their structural composition and molecular morphology. Purple rice protein-polyphenol complexes were separated from purple rice by Osborne sequential extraction. It was found that the purity of purple rice protein was (94.3 ± 2.7)%, and the content of polyphenol was (10.1 ± 4.0) mg/g. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis results indicated that purple rice protein-polyphenol complexes were significantly different from rice glutenin in terms of subunits with molecular weight over 37 ku. The amino acid composition of protein-polyphenol complexes was richer than that of rice glutenin as analyzed by post-column derivatization with ortho phthalaldehyde, with superiority observed in essential amino acid composition according to the FAO/WHO model. The monomeric anthocyanins in purple rice protein-polyphenol complexes, identified by high performance liquid chromatography with diode array detector-mass spectrum, was cynidin-3-O-glucoside and paeonidin-3-O-glucoside. Atomic force microscope showed that the surface topography of purple rice protein-polyphenol complexes was irregularly spherical with particle size of 4.7 nm. This study can provide the scientific basis for further studies on functional and biological characteristics of colored rice.

purple rice; protein-polyphenol complexes; structural composition; molecular morphology; atomic force microscope

10.7506/spkx1002-6630-201621015

Q946.1

A

1002-6630（2016）21-0085-06

梁征, 熊思慧, 郭莹, 等. 紫米蛋白-多酚复合物的结构组成及分子形貌[J]. 食品科学, 2016, 37(21): 85-90. DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201621015. http://www.spkx.net.cn

LIANG Zheng, XIONG Sihui, GUO Ying, et al. Structural composition and molecular morphology of purple rice proteinpolyphenol complexes[J]. Food Science, 2016, 37(21): 85-90. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201621015. http://www.spkx.net.cn

2016-01-04

湖北省自然科学基金项目（2014CFB891）；湖北省科技支撑计划项目（2015BHE015；2015BBA167）；武汉市青年科技晨光计划项目（2014072704011258）

梁征（1991—），男，硕士研究生，研究方向为农产品加工化学与食品营养。E-mail：m13419524142@163.com

*通信作者：何静仁（1974—），男，教授，博士，研究方向为膳食功效物质基础与分子营养。E-mail：jingren.he@whpu.edu.cn