损毁LMAN逆转去势引起的成年雄鸟鸣曲变化

张近春， 王松华， 李东风

(华南师范大学生命科学学院， 广州 510631)



损毁LMAN逆转去势引起的成年雄鸟鸣曲变化

张近春， 王松华， 李东风*

(华南师范大学生命科学学院， 广州 510631)

以成年雄性斑胸草雀为研究对象，去势后成年雄鸟鸣曲空间结构显著改变，平均频率和峰频率下降，主题曲相似度降低，鸣曲稳定性下降；损毁LMAN后，平均频率、峰频率、主题曲相似度都恢复到去势前水平． 去势引起鸣曲结构和稳定性变化． 损毁LMAN逆转鸣曲的变化表明LMAN对雄激素(睾酮)调节鸣曲变化至关重要．

去势； LMAN； 雄激素(睾酮)； 声谱分析； 斑胸草雀

发声对动物种群个体识别、求偶、种族延续等过程至关重要． 目前发声学习的神经生物学研究主要实验动物为鸣禽[1-2]． 鸣禽鸣曲的产生依赖于脑内鸣唱控制系统[3-4]，其与人类有较高同源性． 鸣唱控制系统中有大量雄激素受体(AR)，雄激素通过其受体发挥作用，进而影响鸣曲结构和稳定性． 鸣禽体内的雄激素主要是睾酮(T，Testosterone)． 本实验室前期研究结果表明，去势降低斑胸草雀血浆睾酮水平，引起主题曲相似度明显下降，鸣曲变得不稳定[5]． 然而雄激素(睾酮)是通过哪条发声控制通路传递调控鸣曲的信号，一直悬而未决．

研究已证实，AFP通路与成年鸣禽鸣曲可塑性密切相关，且AFP通路与人类大脑中的皮层-基底神经节-皮层环路在功能上同源[4]． AFP通路的输出核团LMAN直接投射到RA，RA同时也接受来自HVC的传入． 有研究[6]表明，RA所接受的突触输入与鸣曲的稳定性直接相关，LMAN-RA突触控制着鸣曲的可塑性． 所以雄激素可能是通过LMAN-RA通路来发挥作用，本课题组拟对此进行研究． 去势后睾酮含量下降，成鸟鸣曲变得不稳定，如果LMAN-RA通路传递雄激素含量变化信息，那么在去势后损毁LMAN，RA则无法通过LMAN-RA通路接受雄激素含量变化信息． 据此笔者推测损毁LMAN，能逆转由去势引起的成年雄性斑胸草雀鸣曲变化，使鸣曲重新变得稳定．

本研究应用声谱分析方法对去势、损毁LMAN前后的鸣声影响做了观察描述，为雄激素调节成年鸣曲可塑性和学习记忆的神经生物学机制提供了一些实验证据，对了解人类语言学习和记忆机理具有重要意义．

1 材料与方法

1.1 实验动物

实验动物为成年雄性斑胸草雀(TaeniopygiaGuttata)，年龄大于120 d，体质量在12～15 g，购于广州花地湾花鸟虫鱼市场． 雌雄成对饲养于同一笼内，鸟之间能正常进行声音交流，笼养1周，适应环境后开始实验．

1.2 实验试剂

麻醉剂(10%水合氯醛)、灌流试剂(0.75%NaCl，4%多聚甲醛，0.1 mol/L磷酸缓冲液)、固定脱水试剂(4%多聚甲醛，0.1 mol/L磷酸缓冲液，15%、30%蔗糖溶液)、Nissl 染色试剂(0.1%焦油紫溶液，二甲苯，无水乙醇，95%乙醇，75%乙醇，蒸馏水)、中性树脂．

1.3 实验仪器及器材

冰冻切片机(LEICA CM1850)、声音信号采集仪器、外科手术器具、鸟类脑立体定位仪、灌流装置、显微镜(DM2500，Leica)等．

1.4 实验方法

1.4.1 实验流程 (1)术前录音：连续3 d，对健康成年雄性斑胸草雀进行声音采集，获得稳定鸣曲(用Pre表示)． (2)去势手术：获得稳定鸣曲当天，摘除双侧睾丸． (3) 去势后声音采集： 去势后每隔5 d进行声音采集，术后第20天采集到稳定鸣曲(用Cas表示)． (4)损毁手术：对去势后获得稳定鸣曲的斑胸草雀进行双侧损毁LMAN． (5)损毁手术后声音采集：待鸟恢复健康后，进行声音采集，记录下术后第15天、第30天的鸣曲(分别用Les(15)、Les(30)表示)． (6)组织学切片：检测LMAN损毁情况．

1.4.2 声音采集 将单只雄鸟置于笼中，笼子放于测听室内，话筒距鸟笼壁约5 cm，每只雄鸟每次录音2.0 h． Cool Edit Pro 2.1软件将声音片段处理，采样频率为44 100 Hz，单声道，16位分辨率(默认)，分别录制正常状态下和手术后的声音信号样本，保存为*．wav文件．

1.4.3 去势手术 健康成年雄性斑胸草雀完成录音后，取0.03 mL 10%水合氯醛，在胸大肌处进行注射． 待鸟完全麻醉后，腹腔手术摘除两侧睾丸． 待鸟苏醒后正常饲喂，能自由活动后，和雌鸟同笼饲养．

1.4.4 损毁LMAN 对去势后获得稳定鸣曲的健康成年雄性斑胸草雀，胸大肌注射0.03 mL 10%水合氯醛，麻醉，完成头部固定，找到人字缝，用记号笔标记为零点． 依据Barbara E． Nixdorf-Bergweiler绘制的斑胸草雀脑图谱定位核团(坐标：AP 3.7～3.8 mm，L/R ±1.7～1.8 mm，H 0.27 mm )．损毁信号为300 μA的阳极直流电脉冲，持续时间20 s，用缝合针将伤口缝合，并用75%酒精消毒． 待鸟苏醒后正常饲喂，能自由活动后，和雌鸟同笼饲养． 定期进行声音采集．

1.4.5 声学信号处理及数据分析 成年雄性斑胸草雀的主题曲结构稳定，去势后不会引起主题曲音节成分增加或丢失，易于记录和进行分析，在实验室已有研究的基础上分析了雄性斑胸草雀鸣唱水平的主题曲．

首先分析去势、损毁LMAN前后鸣曲结构的变化，声谱参数包括频域性的声学参数：平均频率、峰频率． 在声谱结构分析的基础上，进一步分析了鸣曲稳定性的变化，表征声音稳定性的声学参数：相似度(主题曲水平)． 通过SAP2011(Sound Analysis Pro)软件测定各指标，声学参数代表的意义如下[7]：

平均频率(Mean Frequency)：用于评估功率在频率上分布的主要趋势，单位为赫兹(Hz)．

峰频率(Peak Frequency)：指声音的最高频率，峰频率是最大功率的频率，单位为赫兹(Hz)．

相似度(Similarity Score)：是一种综合性参数，由对2组声音的时域性、频域性和声强参数综合比较后得出，声音的相似度可以有效地衡量鸣曲稳定性，单位为百分比(%)．

1.4.6 组织学检查 用于检查是否成功损毁LMAN． 首先灌流，先用鸟类生理盐水(0.75% Nacl溶液)颈动脉灌注5 min，清除脑内血液，再换4%多聚甲醛固定液灌注约30 min，剥去颅骨，将全脑浸泡在4%多聚甲醛固定液中进行组织固定约24 h，再依次用15%、30%蔗糖溶液浸泡至标本沉底． 第二步进行脑组织切片，使用冰冻切片机进行冠状切片，脑片厚度为40 μm，对脑片进行Nissl染色，再用中性树胶封片，镜检拍照．

1.4.7 声学数据分析与作图 使用Cool Edit 2000软件随机选取主题曲． 用SAP2011软件，在其Explore & Score界面下进行声学分析，在SAP软件的Similarity Batch界面下对同一种主题曲进行对比分析，得出主题曲的相似度，用Similarity Score表示，单位为百分比(%)．

对正常鸣曲和去势组、去势和双侧损毁LMAN组、正常鸣曲和双侧损毁LMAN组的鸣声变化的分析，使用SPSS软件(Version11.5)进行配对的双样本t-检验(Paired Two-Sample t-Test)． 使用Image pro对损毁LMAN的面积进行分析，损毁范围在70%～100%视为损毁成功，纳入有效数据分析；使用Origin软件(Version 8.0)绘制统计图．

2 结果与分析

2.1 鸣曲空间结构分析

本文分析了峰频率和平均频率2个空间结构参数，就LMAN对鸣曲空间结构的影响进行了探究．

2.1.1 鸣曲平均频率分析 去势后，跟踪分析成年斑胸草雀(n=4，分别用No.1、No.2、No.3、No.4表示)的平均频率(图1)，发现平均频率值均下降，在第20天(Cas)达到稳定(去势当天算作第1天)，所以对去势后平均频率数据的分析均来自去势后第20天． 在去势后第20天完成声谱记录后，即刻进行LMAN损毁手术，损毁后平均频率值逐渐上升，分别记录下损毁后第15天Les(15)(损毁当天记作第1天)的平均频率．

Pre:正常组(手术前正常喂养的成年雄性斑胸草雀)； Cas：去势手术后第20天； Les(15)：损毁LMAN后第15天；Les(30)：损毁LMAN后第30天.

图1 去势和双侧损毁LMAN后平均频率的变化(n=4)

Figure 1 Change of mean frequency after castration and LMAN lesion(n=4)

随后对所有实验鸟Pre、Cas、Les(15)进行统计学分析(图2)，Pre和Cas主题曲平均频率进行比较(表1)，去势后平均频率由(3 473.4±34.2) Hz下降至(3 081.1±40.3) Hz；损毁LMAN后回升，Les(15)达到(3 514.4±22.2) Hz，变化达到极显著差异．

图2 Pre、Cas、Les(15)的平均频率变化统计图

参数去势前去势后第20天损毁后第15天平均频率/Hz3473．4±34．23081．1±40．33514．4±22．2峰频率/Hz3344．0±38．72927．3±45．63378．9±25．7主题曲相似度/%63．0±1．754．2±2．065．2±1．2

注：所有的值均用mean±SEM表示.

2.1.2 鸣曲峰频率分析 去势后，跟踪分析成年斑胸草雀(n=4，分别用No.1、No.2、No．3、No.4表示)主题曲的峰频率变化(图3)． 去势后峰频率值均下降，在第20天(Cas)达到稳定． 损毁手术后峰频率值逐渐上升．

图3 去势和双侧损毁LMAN峰频率的变化(n=4)

Figure 3 Change of peak frequency after castration and LMAN lesion(n=4)

最后对所有实验鸟Pre、Cas、Les(15)进行统计学分析(图4)，Pre和Cas主题曲平均频率进行比较(表1)，去势后峰频率由(3 344.0±38.7) Hz下降至(2 927.3±45.6) Hz；损毁LMAN后回升，Les(15)达到(3 378.9±25.7) Hz． 统计结果显示峰频率变化有极显著差异．

图4 Pre、Cas、Les(15)之间峰频率变化统计图

2.2 鸣曲稳定性分析

在分析了去势和损毁LMAN对鸣曲空间结构显著影响的基础上，从主题曲水平对鸣曲稳定性进行评价，对主题曲的相似度进行了分析．

去势后，成年斑胸草雀(n=4，分别用No.1、No.2、No．3、No．4表示)的主题曲相似度下降(图5)，在第20天达到稳定(去势当天算作第1天)，所以对去势后主题曲数据的分析均来自去势后第20天． 在去势后第20天完成声谱记录后，即刻进行损毁手术，损毁后主题曲相似度逐渐上升．

图5 去势和双侧损毁LMAN后主题曲相似度的变化(n=4)

Figure 5 Changeof the similarity of motif after castration and LMAN lesion(n=4)

对所有实验鸟Pre、Cas、Les(15)进行统计学分析，去势前(Pre)和去势后第20天(Cas)主题曲相似度进行比较，去势后主题曲相似度由63.0%±1.7%下降至54.2%±2.0%(图6)；去势后损毁LMAN第15天(Les(15))的主题曲相似度回升至65.2%±1.2%. 实验中，这些变化都达显著性水平．

图6 Pre、Cas、Les(15)之间主题曲相似度变化统计图

Figure 6 Statistical diagram of change of similarity

2.3 组织学检验

采集Pre、Cas、Les(15)、Les(30)的鸣曲后，所有实验鸟灌流取脑，随后将脑切片，待脑片自然干燥后，进行尼氏染色，在显微镜下检验损毁面积，损毁面积大于LMAN核团70%的，纳入到数据分析中，图7C和图7D分别为左右脑LMAN的损毁面积大于70%．

图7 LMAN的组织学切片

3 讨论

利用声谱分析的方法，分别对成年雄性斑胸草雀进行去势手术和损毁LMAN手术，从主题曲水平对鸣曲进行了分析． 结果显示去势后成年雄鸟鸣曲空间结构显著改变，平均频率和峰频率下降，主题曲相似度降低，鸣曲稳定性下降；损毁LMAN后，平均频率、峰频率、主题曲相似度都恢复到去势前水平．

对成年斑胸草雀单独损毁LMAN，不会对鸣曲产生显著影响[8-10]． 去势后主题曲相似度降低，鸣曲稳定性下降；损毁LMAN后相似度恢复． 表明LMAN向RA的投射，参与睾酮含量变化引起的鸣曲可塑性． 损毁LMAN-RA突触，逆转血浆睾酮水平降低引起的鸣曲空间结构和稳定性变化，可能通过以下4条途径实现:

(1)损伤LMAN-RA突触，LMAN向下游靶核团RA谷氨酸能传递中断，进而影响鸣曲稳定性． 与此有关的突触可塑性研究表明，用GABAa受体阻断剂蝇蕈醇使LMAN失活，发现间接鸣曲稳定性增加，音节也变得更稳定，洗去蝇蕈醇后，音节水平的基频、每个音节的频率变化、间接鸣曲可变性恢复到LMAN失活前水平[11]．

(2)损毁手术不仅中断了LMAN向RA的突触传递，还终止了营养物质的输送[12]． LMAN不再向RA输送神经营养因子BDNF． BDNF在RA中的释放依赖神经元活动，LMAN向RA的投射神经元失活时，BDNF的释放就停止了, BDNF释放减少可能对鸣曲变得稳定有重要意义[11]．

(3)生理损伤产生补偿机制，LMAN-RA突触损毁，加强HVC-RA 突触作用． 损伤LMAN向RA的输入，会使HVC向RA突触传递产生相应的快速的结构和电生理变化,HVC向RA突触传递的变化有可能是MMAN、Uva、NIf构成的反馈通路向HVC传递相关信息引起的，出生后40～50 d的鸟，损毁LMAN不会引起细胞死亡，而是导致RA树突形态和胞体体积快速改变，同时加强HVC和RA之间的突触联系[13]．

(4)损毁诱导RA结构改变． 证据显示， 出生后20 d的鸟，损毁LMAN后，引发RA神经元凋亡，向RA注射BDNF能阻止细胞凋亡[14]． 对一些鸣禽的研究发现，神经活动停止时，依旧分泌一些神经营养因子，包括BDNF[15]． 而且，因为在LMAN失活的20～40 min内观察到了对鸣曲的重要影响，因此可以肯定LMAN失活，使LMAN向RA的投射消失，RA产生长时程可塑性．

综上所述，去势引起鸣曲结构和稳定性显著变化． 损毁LMAN逆转鸣曲的变化表明MAN对雄激素(睾酮)调节鸣曲变化至关重要．

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【中文责编：成文 英文责编：李海航】

Castrating-Induced Song Change in Adult Male Zebra Finch (Taeniogygia guttata)is Reversed by LMAN Lesion

ZHANG Jinchun, WANG Songhua, LI Dongfeng*

(School of Life Science, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

Adult male zebra finches were castrated and the song was acoustic analyzed． It was found that the spatial structure of birdsong changed significantly, the mean frequency, peak frequency and similarity of the motifs decreased, the stability of song decreased after castration． Castrating-induced song changes of structure and stability were reversed by LMAN lesion, suggested that LMAN contributes to the effect of testosterone on song regulation．

astration; LMAN; lesion; acoustic analysis; zebra finch

2016-03-20 《华南师范大学学报(自然科学版)》网址：http://journal.scnu.edu.cn/n

国家自然科学基金项目(31472002)

Q62

A

1000-5463(2016)05-0058-05

*通讯作者:李东风，教授，Email:dfliswx@126．com．