羊肚菌A1菌株菌丝体的培养特性*

周洁，谭伟**，曹雪莲，2，苗人云，2，彭卫红，黄忠乾，甘炳成

（1.四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川成都610066；2.四川金地菌类有限责任公司，四川成都610066）

羊肚菌A1菌株菌丝体的培养特性*

周洁1，谭伟1**，曹雪莲1，2，苗人云1，2，彭卫红1，黄忠乾1，甘炳成1

（1.四川省农业科学院土壤肥料研究所，四川成都610066；2.四川金地菌类有限责任公司，四川成都610066）

设计8种碳源、8种氮源、6个梯度温度和8个梯度pH值的试验，对羊肚菌（Morchella importuna）A1菌株进行培养，观察其菌落菌丝体生长势和测定菌丝生长速度，比较分析其菌丝体最适培养特性。试验结果表明，羊肚菌A1菌株菌丝体培养的最适碳源为甘露醇和阿拉伯糖，最适氮源为蛋白胨和(NH4)2SO4，最适温度为15℃～25℃，最适pH值为4.5～5.5。

羊肚菌；菌丝体；碳源；氮源；温度；pH值；生长势；生长速度

羊肚菌（Morchella spp.）又名阳雀菌、羊肚菜等，是羊肚菌科羊肚菌属所有种类的总称，隶属于菌物界（Fungi）子囊菌门（Ascomycota）盘菌纲（Discomycetes）盘菌亚纲（Pezizomycetidae）盘菌目（Pezizales）羊肚菌科（Morchellaceae）羊肚菌属（Morchella）。羊肚菌营养丰富，味道鲜美，欧洲人认为是仅次于块菌的美味食用菌，美国人视为“陆地之鱼”[1]。羊肚菌又是重要的药用菌，传统中医学认为，羊肚菌能益肠胃，化痰理气，治疗消化不良、痰多气短[2]。

国内外诸多科技工作者开展羊肚菌研究工作已有100多年的历史，并致力于能够实现羊肚菌商业化栽培，但栽培试验尤其是商业化栽培成功的报道并不多见。笔者所在四川省农业科学院微生物研究室和金地菌类公司合作，近几年已经成功地在室外大田实现羊肚菌栽培，但是，仍然觉得存在着重现性不甚理想的情况，需要深入了解羊肚菌生物学特性，以提高其栽培稳定性。

黄年来[3]介绍了国外学者T.N.Kaul等的羊肚菌培养特性。陈慧群（1995）[4]，王秀云（1998）[5]，董爱荣、桂明英、张松（2002）[6-8]，努尔古丽·阿布都热合曼、赵春燕、陈芳草（2004）[9-11]、彭璐、任桂梅（2006）[12-13]、柴林山（2010）[14]、朱永真（2011）[15]、谢放（2014）[16]等先后对羊肚菌的生物学特性或生态特性做了试验研究。笔者对本研究所微生物研究室采集、分离和保存的羊肚菌A1菌株进行了菌丝体培养的试验研究，以深入了解其菌丝体生长特性。

1　材料和方法

1.1供试菌株

供试羊肚菌菌株A1菌株（Morchella importuna M.Kuo,O'Donnell&T.J.Volk），来源于四川省农科院土壤肥料研究所微生物研究室。

1.2培养基

1.2.1马铃薯葡萄糖培养基

马铃薯200 g、葡萄糖20 g、磷酸二氢钾0.5 g、硫酸镁0.5 g、维生素B110 mg、琼脂25 g，蒸馏水1 000 mL。该培养基用于活化菌株。

1.2.2葡萄糖蛋白胨培养基

葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、磷酸二氢钾0.5 g、硫酸镁0.5 g、维生素B110 mg、琼脂25 g，蒸馏水1 000 mL。

1.3试验处理设计

1.3.1碳源试验

将1.2.2葡萄糖蛋白胨培养基作为碳源试验的基础培养基，分别以20 g的阿拉伯糖、乳糖、甘露醇、丙三醇、蔗糖、麦芽糖和淀粉7种碳源，替换碳源基础培养基配方中的20 g葡萄糖，同时，以不加碳源设置对照（CK），制作成9种培养基（含CK），即共设计成9个处理的碳源试验，每个处理设3次重复。

1.3.2氮源试验

将1.2.2葡萄糖蛋白胨培养基作为氮源试验的基础培养基，分别以2 g的KNO3、NaNO2、NH4Cl、(NH4)2SO4、尿素、麦芽浸粉和天冬酰胺7种碳源，替换氮源基础培养基配方中的2 g蛋白胨，同时，以不加氮源设置对照（CK），分别制作成9种平板培养基，即共设计成9个处理（含CK）的氮源试验，每个处理设3次重复。

1.3.3温度试验

使用1.2.2葡萄糖蛋白胨培养基，分别在10℃、15℃、20℃、25℃、30℃和35℃共6个温度条件下培养供试菌株，即共设计成6个处理的温度试验，每个处理设3次重复。

1.3.4pH试验

采用0.1 mol·L-1柠檬酸、0.2 mol·L-1磷酸二氢钠缓冲液和1 mol·L-1氢氧化钠溶液，分别将1.2.2葡萄糖蛋白胨培养基调节成pH为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5和8.0的培养基，共计8种培养基，即共设计成8个处理的pH值试验，每个处理3次重复。

1.4试验方法

1.4.1使用平板培养基

1.3中碳源、氮源、温度和pH值试验的培养基均按照常规方法制作，各个试验用培养基均匀地分装于直径9 cm规格的平皿中进行试验。

1.4.2试验观测方法

无菌操作，将A1菌株种块接种于平板培养基表面正中央位置，之后在（25±1）℃培养箱（温度试验按照设计温度梯度进行）中避光培养，每个处理重复3次。

观察A1菌株在各个试验处理上的菌落生长势，主要观察菌丝生长浓密程度和菌丝爬壁力情况。

测定菌丝生长速度，菌株菌丝生长速度以菌落生长半径来表示（即菌丝体在平板培养基上直线生长的有效距离）。

菌落半径的测定：在装有培养基的平皿外表面，以中心为基点画两条垂直直线，沿直线方向测量从接种块边缘至菌落边缘的距离，即菌落生长半径长度。

1.5数据分析

试验数据用SPSS 17.0统计分析软件进行分析。

2　结果与分析

2.1碳源对菌丝生长的影响

羊肚菌A1菌株在供试9种碳源培养基上的培养试验结果表明，其菌丝都能够生长，但浓密程度、爬壁能力有差异。菌丝生长的浓密程度：除了不添加碳源培养基（CK）上的菌丝生长表现为较浓密之外，其余碳源培养基上菌丝生长都浓密；菌丝生长的爬壁能力：在葡萄糖、CK和麦芽糖培养基上菌丝生长的爬壁力较强，在阿拉伯糖、乳糖、甘露醇、丙三醇和蔗糖培养基上菌丝生长的爬壁力强，在淀粉培养基上菌丝生长的爬壁力很强。而且还观察到在阿拉伯糖、甘露糖和淀粉培养基上菌丝生长有变锈色情况发生。虽然本研究用的阿拉伯糖碳源培养基本身有颜色，但是阿拉伯糖培养基上的菌丝面颜色最深（图1、表1）。结果说明，不同碳源对羊肚菌A1菌株的菌丝生长势有不同程度的影响。

图1　羊肚菌A1菌株在不同碳源培养基上菌丝生长势Fig.1Growth vigour of tested stain mycelium in different carbon sources

表1　不同碳源对羊肚菌A1菌株菌丝生长的影响Tab.1Effect of different carbon sources on the growth of Morchella importuna stain A1 mycelium

由表1试验结果数据可知，羊肚菌A1菌株在供试9种碳源培养基上的菌丝生长速度范围为11.9 mm·d-1～15.6 mm·d-1，其菌丝日均生长速度由慢至快顺序依次为蔗糖（11.9 mm·d-1）＜CK（13.4 mm·d-1）＜葡萄糖（13.7 mm·d-1）＜麦芽糖（14.1 mm·d-1）＜淀粉（14.4 mm·d-1）＜丙三醇（14.6 mm·d-1）＜阿拉伯糖（15.5 mm·d-1）=乳糖（15.5 mm·d-1）＜甘露醇（15.6 mm·d-1），在蔗糖培养基上菌丝生长最慢（11.9 mm·d-1），在甘露醇培养基上菌丝生长最快（15.6 mm·d-1）。其中，甘露醇、阿拉伯糖和乳糖培养基的菌丝生长速度之间无极显著差异，但与其它碳源培养基的菌丝生长速度间达到极显著差异。试验结果说明，不同碳源对羊肚菌A1菌株的菌丝生长速度有不同程度的影响。相比之下，含有甘露醇和阿拉伯糖2种碳源的培养基是其菌丝生长速度最快的培养基，加之，这两种碳源培养基上菌株菌丝生长势好（菌丝生长浓密、爬壁力强），因此认为，甘露醇和阿拉伯糖这两种碳源是羊肚菌A1菌株菌丝生长的最适碳源。

2.2氮源对菌丝生长的影响

羊肚菌A1菌株在供试9种氮源培养基上培养试验结果表明，其菌丝都能够生长，但是，观察到其菌丝生长的浓密程度和爬壁能力有差异。其中，在尿素培养基上菌丝生长很浓密和爬壁力很强，而且菌丝生长变为的锈色面大（图2、表2）。结果说明，不同氮源对羊肚菌A1菌株的菌丝生长势有不同程度的影响。

图2　羊肚菌A1菌株在(NH4)2SO4、蛋白胨和尿素3种氮源培养基上菌丝生长势Fig.2Growth vigour of Morchella importuna stain A1 myceliun in(NH4)2SO4,peptone and urea

由表2可知，A1菌株在供试9种碳源培养基上的菌丝生长速度范围为7.5 mm·d-1～15.5 mm·d-1，其菌丝日均生长速度由慢至快顺序依次为尿素（7.5 mm·d-1）＜NaNO2（11.1 mm·d-1）＜NH4Cl（12.4 mm·d-1）＜KNO3（12.7 mm·d-1）＜天冬酰胺（13.7 mm·d-1）＜CK（14.6 mm·d-1）＜蛋白胨（14.8 mm·d-1）=麦芽浸粉（14.8 mm·d-1）＜（NH4）2SO4（15.5 mm·d-1），在尿素培养基上菌丝生长最慢（7.5 mm·d-1），在(NH4)2SO4培养基上菌丝生长最快（15.5 mm·d-1）。其中，在蛋白胨、麦芽浸粉、CK和(NH4)2SO4这四种氮源培养基上菌丝生长速度之间无极显著差异，但与其它氮源培养基的菌丝生长速度相比达到极显著差异。试验结果说明，不同氮源对羊肚菌A1菌株的菌丝生长速度有不同程度的影响。相比之下，含有蛋白胨和(NH4)2SO4两种氮源的培养基是其菌丝生长速度最快的培养基，加之，这两种氮源培养基上菌丝生长势好（菌丝生长浓密、爬壁力强）。这表明，蛋白胨和(NH4)2SO4两种氮源是羊肚菌A1菌株菌丝生长的最适氮源。

2.3温度对菌丝生长的影响

不同温度对羊肚菌A1菌株菌丝生长的影响情况见表3。

表2　不同氮源对羊肚菌A1菌株菌丝生长的影响Tab.2Effect of different nitrogen sources on the growth of Morchella importuna stain A1 mycelium

表3　不同温度对羊肚菌A1菌株菌丝生长的影响Tab.3Effect of different temperature on the growth of Morchella importuna stain A1 mycelium

由表3可知，A1菌株在6个温度梯度下培养，其菌丝生长速度范围为3.5 mm·d-1～17.9 mm·d-1，菌丝日均生长速度由慢至快顺序依次为30℃（3.5 mm· d-1）＜10℃（5.0 mm·d-1）＜35℃（5.1 mm·d-1）＜15℃（11.6 mm·d-1）＜20℃（15.3 mm·d-1）＜25℃（17.9 mm·d-1），菌株在30℃温度下菌丝生长速度最慢（3.5 mm·d-1），25℃温度下菌丝生长速度最快（17.9 mm· d-1）。其中，20℃和25℃温度下菌丝生长速度之间无极显著差异，但与其它温度梯度下菌丝生长速度相比达到极显著差异。结果表明，温度15℃～25℃是羊肚菌A1菌株菌丝生长的最适培养温度。

2.4pH值对菌丝生长的影响

在pH值试验中，随着pH值上升培养基颜色也加深，所以本试验中pH值7.5和8.0显示的是培养基本身的颜色（图3）。

图3　羊肚菌A1菌株在不同pH值培养基上菌丝生长势Fig.3Growth vigour of Morchella importuna stain A1 myceliun in different pH

羊肚菌A1菌株在供试8个梯度pH值下培养试验结果表明，其菌丝都能够生长，但是，观察到其菌丝生长的浓密度及爬壁能力有所差异。在pH值5.0、6.0、6.5和7.0下菌丝变锈色（图3、表4）。结果说明，不同碳源对羊肚菌A1菌株的菌丝生长势有不同程度的影响。

由表4可见，A1菌株在8个pH值下培养，其菌丝生长速度范围为1.1 mm·d-1～11.7 mm·d-1，其菌丝日均生长速度由慢至快顺序依次为pH 8（1.1 mm·d-1）＜pH 7.5（4.8 mm·d-1）＜pH 7.0（8.1 mm·d-1）＜pH 6.5（9.2 mm·d-1）＜pH 6.0（10.5 mm·d-1）＜pH 5.0（11.3 mm·d-1）＜pH 5.5（11.4 mm·d-1）＜pH 4.5（11.7 mm·d-1），pH为8条件下菌丝生长速度最慢（1.1 mm·d-1），pH值4.5条件下菌丝生长速度最快（11.7 mm·d-1）。其中，pH值4.5、5.0和5.5条件下菌丝生长速度间无极显著差异，但与其它pH值梯度下菌丝生长速度相比达到极显著差异。结果表明，培养基pH值4.5～5.5是羊肚菌A1菌株菌丝生长的最适培养pH值。

表4　不同pH值对羊肚菌A1菌株菌丝生长的影响Tab.4Effect of different pH on the growth of Morchella importuna stain A1 mycelium

表5　几种羊肚菌最适培养条件的比较Tab.5Comparison on optimal culture conditions of the Morchella

3　小结与讨论

3.1羊肚菌A1菌株培养特性

本试验结果表明，羊肚菌A1菌株菌丝体培养的最适碳源为甘露醇和阿拉伯糖，最适氮源为蛋白胨和(NH4)2SO4，最适温度为15℃～25℃，最适pH值为4.5～5.5。

3.2羊肚菌特性因菌株而异

笔者将本试验研究结果与其他学者关于羊肚菌培养的主要研究结果进行比较（表5）认为，羊肚菌的培养特性因菌株不同而不同。这与广义羊肚菌指羊肚菌属[1]，属内有多个种，种中又有不同菌株密切相关。根据杜习慧等[17]文献，目前已知羊肚菌属有61个种，东亚或中国分布了该属近一半的物种（30种），欧洲分布有23种，北美分布有19种。物种及种内菌株的分布地域不同，菌株长期适应当地环境条件，形成了菌株自身的种性特点。

3.2.1最适碳源

本试验结果表明供试菌株A1菌丝体培养的最适碳源为甘露醇和阿拉伯糖，与其他人的结果有所不同：如董爱荣研究的最适碳源为蔗糖[6]，张松和朱永真研究的最适碳源为淀粉[8，15]，陈芳草研究的最适碳源为葡萄糖、蔗糖[11]，赵春燕[10]、彭璐[12]、任桂梅[13]和柴林山[14]研究的最适碳源为葡萄糖，谢放[16]研究的最适碳源分别为葡萄糖、麦芽糖、淀粉（因菌株而异）。

3.2.2最适氮源

本试验结果表明供试菌株A1菌丝体培养的最适氮源为蛋白胨和（NH4）2SO4。其中的蛋白胨结果与张松[8]、陈芳草[11]、彭璐[12]和谢放[16]等的结果相一致。

3.2.3最适温度

本试验结果表明供试菌株A1菌丝体培养的最适温度为15℃～25℃。这与陈慧群[4]研究的22～24℃、赵春燕[10]研究的24℃相近，与王秀云[5]、董爱荣[6]、彭璐[12]、柴林山[14]和谢放[16]研究的25℃结果吻合，而与陈芳草[11]研究的15℃～20℃相同。

3.2.4最适pH

本试验结果表明供试菌株A1菌丝体培养的最适pH值为4.5～5.5。这个结果的上限值pH值5.5与董爱荣[6]研究的pH值5.0～6.0和陈芳草[11]研究的pH值5.0～7.0的部分结果相同。与其他人的结果不一致，如陈慧群[4]研究的pH值7.0～7.5，王秀云[5]研究的pH值7.0，张松[8]研究的pH值6.0～7.0，赵春燕[10]和柴林山[14]研究的pH值7.5，谢放[16]研究的pH值6.0～8.0。

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Mycelium Cultivation Characteristics of Morchella importuna A1 strain

ZHOU Jie1,TAN Wei1,CAO Xue-lian1,2,MIAO Ren-yun1,2,PENG Wei-hong1, HUANG Zhong-qian1,GAN Bing-cheng1
(1.Soil and Fertilizer Institute,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China; 2.Sichuan Jindi Fungus Co.Ltd.,Chengdu 610066,China)

Eight carbon sources,eight nitrogen sources,six gradient temperatures and eight pH to culture mycelium of Morchella importuna A1 strain were devised.The cultivation characteristics of growth vigour and growth rate were analyzed.The results revealed that the optimal cultural characteristics of A1 mycelium under the below condition were gained,such as mannitol and arabinose as the best carbon sources,peptone and(NH4)2SO4as the best nitrogen sources,temperature between 15℃to 25℃, pH between 4.5 and 5.5.

Morchella;mycelium;carbon source;nitrogen source;temperature;pH;growth vigor;growth rate

S646.9

A

1003-8310（2016）04-0012-06

四川省财政创新能力提升工程项目（青年基金）（2013QNJJ-017）。

周洁（1983-），女，硕士，助理研究员，主要从事食用菌遗传育种研究。E-mail:caoqianyou88@qq.com

**通信作者：谭伟（1964-），男，硕士，研究员，主要从事主要从事食用菌育种与栽培研究。E-mail:332528058@qq.com

2016-05-15