应用aCGH技术建立胚胎植入前遗传学筛查

黄伟伟 卢建 董云巧 陈创奇 杨曦 尹爱华

(1.广东省妇幼保健院，广东 广州 511400； 2. 河南科技大学医学技术与工程学院，河南 洛阳 471003)



应用aCGH技术建立胚胎植入前遗传学筛查

黄伟伟1卢建1董云巧1陈创奇1杨曦2尹爱华1

(1.广东省妇幼保健院，广东 广州 511400； 2. 河南科技大学医学技术与工程学院，河南 洛阳 471003)

目的 应用微阵列比较基因组杂交技术(aCGH)对移植前胚胎进行染色体遗传学筛查，建立胚胎染色体非整倍体检测方法。方法 对冷冻囊胚、对照质控品先进行全基因组扩增，然后再继续aCGH检测。结果 4个冷冻囊胚中1个染色体正常，另外3个染色体异常，对照质控全部检测出。结论 应用全基因组扩增以及aCGH 技术，对囊胚成功进行了植入前遗传学筛查，能够全面评估胚胎染色体的非整倍体情况，为复发流产患者提高生殖成功率提供重要依据。

全基因组扩增；比较基因组杂交；非整倍体；植入前遗传学筛查

辅助生殖中常出现胚胎发育停滞、反复种植失败及多次自然流产，原因多为胚胎染色体异常、非整倍体为主要因素，包括单体、三体(常见13、15、16、18、21、22、和X)及嵌合体等。有研究显示，流产胚胎的50%～60%左右存在染色体核型异常[1]。胚胎植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening, PGS) 便是一种在体外受精后活检，进行染色体非整倍性筛查, 选择染色体整倍性的胚胎植入,提高胚胎妊娠成功率和降低流产率的辅助技术，是一种低风险的植入前遗传学检测技术[1]。染色体行微阵列比较基因组杂交(array comparative genomichybridization, aCGH) 检测,一次可以检测所有的染色体数目异常以及每条染色体全长的情况[2-4]。对复发流产患者进行PGS检测，以期能提高辅助生殖成功几率[5]。

1 资料与方法

1.1 研究对象 胚胎：选取本院生殖健康与不孕症科行体外受精胚胎移植并已分娩正常婴儿的患者冻存的受精胚胎，常规解冻后存活的胚胎用于本研究。患者夫妇均自愿放弃冷冻胚胎，同意捐献用于科研，签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 胚胎活检可活检 将冷冻的胚胎复苏，用激光在透明带空隙较大处打孔，然后换囊胚培养液行囊胚培养，在显微操作仪下用固定针避开内细胞团固定囊胚，活检针从扩张出的滋养层细胞处吸取4～10个细胞，边抽吸边用激光从细胞连接处打断后吸取细胞团。活检获得的滋养层细胞，用1×PBS(simga, 美国)各洗涤3遍，移入预先加入5μl无核酸水的PCR 管中。

1.2.2 全基因组扩增 采用试剂盒WGA4(美国Sigma) 对单细胞进行全基因组扩增(whole genome amplification，WGA),设置末次洗涤液作为空白对照，正常男性为参考DNA(100pg)[6]，13、18、21-三体DNA(100pg)作为阳性对照，正常女性DNA(100pg)作为阴性对照。WGA4包括细胞裂解DNA 片段化、扩增前处理和扩增3 个步骤。WGA的扩增产物用1.2g/L琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.3 染色体非整倍性筛查 采用美国agilent公司aCGH芯片检测系统。待检胚胎和正常男性参考DNA、16、18、21-三体、正常女性DNA经过全基因组扩增后，各取13μl经过荧光标记、 纯化、杂交、洗涤、扫描等步骤获得扫描图片, Feature Extraction 10.7.3.1软件(美国agilent公司) 进行图片数据提取，应用CytoGenomics 2.7.8软件(美国agi-

lent公司) 进行染色体分析。具体实验流程参考agilent公司的Oligonucleotide Array-Based CGH for Single Cell Analysis标准操作规程(www.genomics.agilent.com)。

2 结果

从电泳图上(图1)可以看出，除空白对照外，其余样品均扩增出弥散带，说明WGA4扩增成功。

图1 全基因组扩增产物电泳

M：DNA Marker，1：正常男性参照，2：正常女性对照，3：16-三体对照，4:18-三体对照，5：21-三体对照，6-9:4个囊胚，10：空白对照

数据分析软件CytoGenomics 2.7.8使用ADM-2(Aberration Detection Method-2 algorithm)算法阈值为6.0，染色体缺失探针的阈值log2为0.45，染色体重复探针的阈值log2为0.35，经过aCGH分析，三个阳性对照分别检查出13、18、21-三体，也检测出正常女性对照；4个囊胚分别为：正常、14-三体、18和21-三体、22单体，如图2所示。

图2 4个囊胚的PGS分析结果

3 讨论

单细胞24条染色体非整倍体分析，非常重要的第一步就是进行全基因组扩增，由于单细胞DNA的含量仅为6～7pg(Dolezel et al., 2003)，而微阵列芯片检测需要纳克级的DNA才能进行，所以开展PGS 需要进行全基因组扩增。目前，全基因组扩增主要基于3种原理[7]：①聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)，使用随机引物或部分随机引物通过热循环扩增，对随机片段化的DNA进行扩增，以Sigma公司的“GenomePlex” 技术为代表(WGA4)；②多重置换扩增(multiple displacement amplification，MDA)，是一种非PCR的扩增技术，在恒温条件下，使用Phi29DNA聚合酶、随机引物进行全基因组扩增，Phi29DNA聚合酶具有较高的扩增效率和保真性，扩增产物大于10kb，以Qiagen公司的“REPLI-g”技术为代表；③多重退火环状循环扩增(multiple annealing and looping-based amplification cycles，MALBAC)，该法通过准线性预扩增来降低非线性产物，使用由27个碱基的特异接头和8个碱基的随机序列组成的引物，在0℃时引物均匀地杂合到模板DNA上，65℃时具有链置换活性的DNA聚合酶发生作用，生成0.5～1.5kb中间产物，而后94℃发生变性，接着58℃退火，这些中间产物作为模板聚合形成两端序列反向互补的环状产物(避免产物交叉杂交)，5个循环后进行PCR，产物可达到数微克[8]。

PCR全基因组扩增和MDA全基因组扩增方法，临床应用较为普遍，Nathan R. Treff[9]将PCR基础的全基因组(simga WGA4试剂盒)和MDA全基因组扩增(qiangen REPLI-g试剂盒、GE GenomiPhi DNA 扩增试剂盒)进行了比较，发现WGA4试剂盒更适合进行微阵列拷贝数变异分析(CNV)。MALBAC全基因组扩增方法由ZongChenghang[8]2012年首次提出，目前临床应用较少，但其优越性较其他几种扩增方法显而易见，相信以后会是微阵列和二代测序重要的伴侣。全基因组扩增必须在没有序列倾向性的前提下大幅度提高DNA的总量，但是没有一种全基因组扩增方法能保证单细胞扩增的线性，主要涉及等位基因丢失、等位基因扩增不一致等，有可能会导致aCGH无法准确检测出相应的染色体缺失或重复，不同的芯片检测平台，需要应用其适应的WGA方法[3]。我们使用PCR基础的Sigma公司WGA4试剂盒，能明显地检测出13、18、21-三体3个阳性对照和1个正常女性对照，囊胚细胞的PGS检测的结果也显著。

PGS获取生殖细胞或胚胎组织的方法主要有2种：卵裂球活检及囊胚细胞活检。卵裂球活检：体外授精后第3天，胚胎发育到6～10 细胞期, 从中取出1～2个卵裂球行染色体分析，卵裂期染色体嵌合发生率较高, 此时的染色体分析可能代表不了胚胎的染色体组成[10]。囊胚细胞活检( blastocyst biopsy) ：在体外授精后的第5 天或第6 天进行, 胚胎发育成滋养外胚层细胞(发育为胎盘)和内胚层细胞(发育为胎儿)[2]。囊胚期PGS只取滋养外胚层5～10 个细胞进行检测，而保持了胎儿的内胚层细胞的完整性[11]。另外从卵裂球到囊胚期发育过程中，染色体有问题的细胞会被自然淘汰；在囊胚期较卵裂期取得的单细胞量大，PGS分析结果更加稳定。随着囊胚培养、胚胎冷冻和解冻技术的提高，囊胚滋养外胚层活检凭借其对胚胎损伤小、染色体整倍性比率高、 嵌合少的优点, 已逐渐被临床推广应用[1]。PGS阳性对照、正常女性对照的检测结果与样品类型一致；活检的4个囊胚中1正常，其余3个异常。本实验结果表明，应用aCGH技术成功建立了一种对早期胚胎进行植入前遗传学筛查的方法。

PGS使产前筛查检测时间已经从孕11～13周提前到胚胎植入前，为更好的降低出生缺陷提供了帮助。传统的荧光原位杂交技术也能用于PGS, 但只能对 3～7对染色体的检测, 不能完全反映 23 对染色体的总体状况。aCGH应用于PGS，不需要针对异常位点制备特殊的探针，一次可以检测24条染色体非整倍体数目异常以及染色体重复和缺失，并且能获得异常片段的位置和大小，该技术具有通量高、灵敏度高等特点，可以在24小时完成检测。虽然 aCGH应用于PGS有许多优点, 但该技术也存在一定的局限性，检测分辨率只有5～10Mb，另外aCGH不能检测出点无染色体拷贝数变化的结构异常，如平衡易位和倒位等，对嵌合体、多倍体和单倍体的检测能力。

[1] 王珺,肖西峰,李懋,等.自然流产患者绒毛与复发性流产患者胚胎植入前遗传学筛查微阵列比较基因组杂交结果对比分析[J].生殖与避孕,2014,34(9):714-717.

[2] 张倩，郑叶，颜军昊.胚胎植入前遗传学筛查的临床应用[J].国际生殖健康/计划生育杂志,2014 ,33(3):197-200.

[3] Konings P, Vanneste E, Jackmaert S,et al.Microarray analysis of copy number variation in single cells[J]. Nat Protoc,2012,7(2):281-310.

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[5] 王珺,张靖,黄剑磊,等.微阵列比较基因组杂交胚胎植入前遗传学筛查技术在复发性流产患者中的应用研究[J].生殖与避孕,2014,34(2):121-125.

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编辑：宋文颖

Objective By using the technique of microarray comparative genomic hybridization (aCGH), the aim of this study is to carry out preimplantation genetic screening and establish a method for the detection of chromosomal aneuploidy. Method Whole genome amplification (WGA) was performed on the frozen blastocyst and control samples, and then the products of WGA were detected by aCGH. Results One of the four frozen embryos was normal, while the others were abnormal.The controls have all been successfully detected, just as expected. Conclusions The application of WGA combined with aCGH has been proved to be effective in embryo preimplantation genetic screening. It can help to comprehensively evaluate the chromosomal aneuploidy in embryos, and thus provid an important foundation for improving the reproductive success rate of patients with recurrent spontaneous abortion.

whole genome amplification(WGA)； microarray comparative genomic hybridization(aCGH)； aneuploidy；preimplantation genetic screening(PGS)

10.13470/j.cnki.cjpd.2016.03.004

国家自然科学基金青年科学基金(31401136)；广东省自然科学基金(S2012010008318)

R714.55

A

2016-05-30)

*通信作者：尹爱华，E-mail：yinaiwa@vip.126.com