雅连酒炙多糖成分转化及免疫活性比较的研究

管勇舟，王秋红，严光玉，匡海学*

(1.教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.洪雅县瓦屋山药业有限公司，四川 洪雅 620000)



雅连酒炙多糖成分转化及免疫活性比较的研究

管勇舟1，王秋红1，严光玉2，匡海学1*

(1.教育部北药基础与应用研究重点实验室，黑龙江省中药及天然药物药效物质基础研究重点实验室，黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.洪雅县瓦屋山药业有限公司，四川 洪雅 620000)

目的：研究雅连酒炙后多糖含量变化及免疫活性变化。方法：采用水提醇沉法提取多糖，苯酚硫酸法测定总多糖含量，Savag法除蛋白，体外ConA、LPS诱导脾细胞增殖实验测定多糖的免疫活性。结果：雅连炮制前后多糖含量依次为2.04%、1.32%；糖蛋白含量依次为1.52%、1.42%；糖醛酸含量依次为25.90%、33.27%；ConA、LPS诱导的脾细胞增殖实验中，炮制和未炮制雅连的多糖都具有抑制作用，炮制后雅连的多糖抑制作用增强；除蛋白后，炮制和未炮制雅连的多糖都具有免疫增强作用。结论：与糖结合蛋白和糖醛酸含量变化可能是酒炙雅连多糖免疫活性化的影响因素。

雅连；多糖；免疫活性

雅连又名峨眉连、嘉定连、刺盖连，为植物三角叶黄连(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et H siao)的干燥根茎，为黄连药典品种之一。 黄连始载于《神农本草经》，列为上品，味苦，寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经[1]，具有清热燥湿，泻火解毒的功效。用于湿热痞满，目赤，黄疸，高热神昏，心火亢盛等。现代药理学研究其具有抗菌[2-3]、神经保护[4]、抗癌、降血糖[5-6]和改善心脑血管功能的作用[7-8]。历代本草对黄连加工炮制方法的记载颇多，其中酒炙黄连可降低苦寒之性，是中药炮制理论“相反为制”的典型代表。酒炙黄连还能引药上行[9],善清头目之火,用于目赤肿痛、口舌生疮等。前期研究主要围绕雅连小分子成分进行指纹图谱研究[10]，炮制前后小分子液质分析[11]，但是雅连临床用药方式为水煎煮后服用，小分子溶出量较少，多糖成分却在水煎煮中大量溶出，并伴随患者用药进入人体。因此，为了阐明酒炙法对雅连多糖的影响，本实验研究了雅连酒炙前后多糖含量、蛋白含量、糖醛酸含量及免疫活性的变化。

1 仪器、试剂、药材和动物

紫外可见分光光度计(上海元析仪器有限公司)；电子分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；酶标仪(Bio-Tek公司)；牛血清白蛋白(Sigma 公司)；ConA蛋白(Sigma 公司)；LPS脂多糖(Sigma 公司)；RPMI 1640培养基(美国Hyclong公司)；胎牛血清(美国Hyclong公司)；噻唑蓝(MTT,Sigma公司)；黄酒(浙江省塔牌绍兴酒有限公司)。雅连采购于四川省眉山市洪雅县瓦屋山药业，经黑龙江中医药大学中药资源学教研室苏连杰教授鉴定为植物三角叶黄连(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao)的干燥根茎。BALB/c小鼠，雄性，体质量18～22 g，合格证号为SYXK黑2008001，由黑龙江中医药大学药物安全性评价中心提供。

2 方法

2.1 雅连的炮制

取一定量雅连药材洗净后，软化切片，厚度约为1.5 mm，按药材质量：黄酒体积为8:1量取黄酒，用黄酒将雅连喷润后，置于烘箱中，165℃烘烤20 min。

2.2 雅连多糖的制备

分别称取50.0 g生品和酒炙雅连，用10倍量80%乙醇热回流提取3次，每次2 h，再用10倍量的水热回流提取3次，每次2 h，合并水提液，定容到1 L容量瓶中，苯酚-硫酸法[12]测定多糖含量。向水提液中加入95%乙醇溶液至上清液醇浓度为85%，4℃静置24 h后双层滤纸过滤，无水乙醇和丙酮交替洗涤沉淀至溶液无色。将沉淀水溶解，离心后过滤，截留分子量3500 D的透析袋后，浓缩，冻干得粗多糖。分别精密称取一定量的粗多糖配成5%多糖溶液，采用Savag法[13]除蛋白。分别精密称取10.0 mg多糖，用考马斯亮蓝法[14]测定多糖溶液蛋白含量。采用硫酸咔唑法[15-16]测定多糖糖醛酸含量。

2.3 雅连多糖免疫活性的测定

2.3.1 小鼠脾淋巴细胞制备

取BALB/c小鼠4只。眼球放血后，颈椎脱臼处死，浸泡于75%酒精中。于超净台中无菌取脾，置于盛有PBS的培养皿中，研磨后过200目筛网，用PBS培养基冲洗，1000 r/min离心10 min，弃去上清液；加入5 mL预冷红细胞裂解液，4℃裂解3 min，1000 r/min离心10 min；加6 mL完全培养基，混匀，用血球计数板计数细胞，调整细胞浓度至5×106个/mL。

2.3.2 炮制前后总多糖和脱蛋白后总多糖对小鼠脾细胞体外增殖的影响

2.3.2.1 对ConA诱导小鼠脾细胞体外增殖影响

将制备的小鼠脾淋巴细胞接种于96孔培养板中，每组设6个复孔，每孔加细胞悬液100 μL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后除空白对照组外，其他组加入ConA使其终浓度为5 μg/mL，空白组加入等量的不完全培养液。置于37℃、5%培养箱中培养，24 h后各给药组每孔分别加入药物20 μL，空白组和模型组加入等体积不完全培养液，37℃、5% CO2再培养48 h，培养结束后每孔加入5 mg/mL MTT 50 μL，孵育4 h。小心吸除上清，再加入二甲基亚砜100 μL，于震荡器上缓慢作用10 min，在酶标仪上于492 nm处测吸光度(OD)值[17]。

2.3.2.2 对LPS诱导小鼠脾细胞体外增殖影响

将制备的小鼠脾淋巴细胞接种于96孔培养板中，每组设6个复孔，每孔加细胞悬液100 μL，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后除空白对照组外，其他组加入LPS使其终浓度为10 μg/mL，空白组加入等量的不完全培养液。置于37℃、5%培养箱中培养，24 h后各给药组每孔分别加入药物20 μL，空白组和模型组加入等体积不完全培养液，37 ℃、5% CO2再培养48 h，培养结束后每孔加入5 mg/mL MTT 50 μL，孵育4 h。小心吸除上清，再加入二甲基亚砜100 μL，于震荡器上缓慢作用10 min，在酶标仪上于492 nm处测吸光度(OD)值。

3 结果和分析

3.1 酒炙对雅连多糖含量的影响

按葡萄糖标曲绘制标准曲线为Y=0.0098X-0.0133。测得生品雅连多糖含量为2.02%，酒炙雅连多糖含量为1.32%。说明酒炙后降低多糖得率，可能是加热致使多糖降解的缘故。

3.2 酒炙对雅连多糖蛋白含量的影响

按蛋白标准曲线绘制标准曲线为Y=0.0024X-0.0186。测得生品雅连多糖糖蛋白含量为2.59%，酒炙雅连多糖蛋白含量2.43%。除蛋白后，生品蛋白含量为0.86%，酒炙雅连蛋白含量为0.82%。说明多糖经过酒炙后糖蛋白含量有所下降。

3.3 酒炙对雅连多糖糖醛酸含量的影响

按半乳糖醛酸标曲绘制标准曲线为Y=9.2628X+0.0283。测得生品雅连多糖糖醛酸含量为25.90%，酒炙雅连多糖糖醛酸含量为33.27%。说明炮制后雅连多糖糖醛酸含量升高。

3.4 酒炙对雅连多糖免疫活性的影响

对ConA诱导的脾细胞增殖结果见表1、图1，生品雅连多糖和酒炙雅连多糖在一定浓度下对ConA诱导的脾细胞增殖均有抑制作用，且随着浓度增加，抑制作用减弱；除蛋白后，生品雅连多糖对ConA诱导脾细胞增殖具有协同抑制作用，且随多糖浓度增加协同作用减弱；酒炙雅连多糖对ConA诱导脾细胞增殖协同抑制作用增加，随多糖浓度增加协同作用增强。

表1 多糖对ConA诱导脾细胞增殖影响

注：与ConA组相比，**P<0.01，*P<0.05；与空白组相比，△△P<0.01。

图1 多糖对ConA诱导脾细胞增殖影响注：与ConA组相比，**P<0.01，*P<0.05；与空白组相比，△△P<0.01。

对LPS诱导的皮细胞增殖见表2、图2，雅连生品多糖和酒炙雅连多糖对LPS诱导的脾细胞增殖均有抑制作用，且随着多糖浓度增加抑制作用减弱；除蛋白后，生品雅连多糖对LPS诱导脾细胞增殖有协同抑制作用，随浓度增加协同作用减弱；酒炙雅连多糖对LPS诱导脾细胞增殖有抑制作用。

表2 多糖对LPS诱导脾细胞增殖影响

注：与LPS组相比，**P<0.01，*P<0.05；与空白组相比，△△P<0.01。

图2 多糖对LPS诱导脾细胞增殖影响注：与LPS组相比，**P<0.01，*P<0.05；与空白组相比，△△P<0.01。

4 讨论

本实验采用酒炙的炮制方法，研究炮制前后雅连多糖、多糖蛋白、多糖糖醛酸含量变化，同时研究了不同雅连炮制品多糖对ConA、LPS诱导脾细胞增殖影响。结果表明，酒炙后，雅连多糖、多糖蛋白及多糖糖醛酸得率均降低，可能是加热使其降解所致。免疫细胞是免疫系统的重要组成部分，T、B淋巴细胞在机体特异性免疫发挥重要作用，其数量和活性影响机体免疫能力。T、B淋巴细胞又称为免疫活性淋巴细胞，ConA是T淋巴细胞的促有丝分裂剂，LPS是B淋巴细胞的促有丝分裂剂。能够和体外ConA或LPS诱导脾细胞增殖有协同抑制作用的药物可能是T、B细胞免疫功能的促进剂，相反则为抑制剂。实验结果表明，生品雅连多糖能够抑制ConA、LPS诱导脾细胞增殖，酒炙雅连对ConA、LPS诱导脾细胞增殖的抑制作用增强，推测其原因可能是酒炙后雅连多糖蛋白和糖醛酸含量变化引起多糖免疫活性变化所致；除蛋白后，生品雅连多糖和酒炙雅连多糖对ConA、LPS诱导脾细胞增殖有协同抑制作用，说明与糖结合的蛋白变化可能是雅连酒炙后多糖免疫活性物质变化的物质基础。本文从多

糖角度，研究了雅连酒炙后多糖含量变化及其药理活性变化，从免疫角度阐明雅连酒炙后多糖活性变化，为研究雅连酒炙的炮制的意义奠定了基础，为今后揭示雅连酒炙后药效物质基础提供了依据。

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国家自然科学基金项目(No.81473351)；国家“973”课题项目(No.2013CB531801)

管勇舟(1990-)，男，黑龙江中医药大学在读硕士，主要研究方向：中药化学成分的研究。

匡海学*(1955-)，男，教授，博士研究生导师，主要从事中药及天然药物药效物质基础,中药药性理论研究工作。

2016-04-08

R285.5

A

1002-2406(2016)05-0012-03

修回日期：2016-05-01