新生儿缺氧缺血性脑病TLRs表达及分析

刘晓红

河北邯郸市中心医院新生儿科 邯郸 056001



新生儿缺氧缺血性脑病TLRs表达及分析

刘晓红

河北邯郸市中心医院新生儿科 邯郸 056001

目的 分析新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)的Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)及相关细胞因子的表达，探索免疫系统在HIE发病过程中的作用。方法 收集入住我院66例HIE患儿，根据病情分为轻度、中度和重度3组，选取32例正常新生儿为对照组，应用ELISA法检测IL-2、IL-4、TNF-α、TLR-4、TLR-9的表达水平。结果 HIE患儿IL-2、TNF-α、TLR-4、TLR-9表达增加(P<0.05)，且随着病情严重程度而明显增加(P<0.01)；IL-4在重度HIE中表达显著减少(P<0.01)。 结论 新生儿缺氧缺血性脑病免疫应答主要以Th1诱导的细胞免疫应答为主；TLRs可作为治疗靶点，为HIE的防治提供理论基础。

新生儿缺氧缺血性脑病；Toll样受体；细胞因子；免疫应答

新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic ischemic encephalopathy，HIE)是围生期由于窒息引起的严重并发症之一，会导致脑组织缺氧缺血性损伤。新生儿缺氧缺血性脑病临床症状多见新生儿出现意识障碍、肌张力改变以及惊厥等神经精神障碍，严重者发生脑瘫、癫痫等HIE后遗症，甚至威胁新生儿的生命[1-2]。HIE发生机制较为复杂，神经系统可通过分泌神经递质、内分泌激素以及自身细胞产生的细胞因子调节免疫系统，而免疫系统则通过细胞免疫应答、体液免疫应答和固有免疫应答，以及免疫细胞分泌的细胞因子反馈作用于神经-内分泌系统，从而构成精密的神经-免疫-内分泌网络[3-4]。近年来随着对神经-免疫-内分泌网络研究的深入，免疫系统功能异常在HIE的发生中的作用备受关注。Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)家族在机体免疫功能调节中有重要作用，但目前对其在新生儿HIE中的表达研究较少。本研究分析HIE患儿血清TLR-4及TLR-9及相关细胞因子的表达，探索免疫系统在HIE发病过程中的作用，为进一步防治新生儿缺氧缺血性脑病提供理论依据。

1 资料与方法

1．1 研究对象 选取2013-01—2013-12入住我院儿科新生儿重症监护室的HIE患儿66例，男36例，女30例；胎龄37～42(38±2)周；出生体质量2 200～2 500 g 10例，>2 500～4 000 g 38例，>4 000～4 500 g 18例；日龄1～3 d；母乳喂养11例，配方奶喂养36例，混合喂养19例；自然分娩26例，剖宫产40例；羊水清亮者9例，Ⅰ度粪染19，Ⅱ度粪染21例，Ⅲ度粪染17例。所有患儿符合足月新生儿HIE诊断标准。临床分度：轻度21例，中度28例，重度17例。所有入选患儿符合2005年中华医学会儿科学分会新生儿学组修订的诊断标准。排除感染性疾病、肝肾功能受损等并发症患者。随机选择同期入住我院产科正常新生儿32例为对照组，男18例，女14例；胎龄37～42(38±2)周；日龄1～3 d。2组性别、胎龄、体质量、产式等一般资料差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。2组新生儿无其他先天性疾病、感染病史、宫内发育迟缓。本研究经医院伦理委员会批准，所有研究对象的直系亲属均签署相关知情同意书。

1．2 研究方法

1．2．1 标本采集与处理：分别于出生1～3 d内对HIE组和对照组新生儿于08：00采集股静脉血2 mL，静置30 min后，在室温条件下，以2 000 r/min的速度匀速离心 15 min后，留取上清液。对所取血清编号后，立即置于-80 ℃冰箱中冻存待用。

1．2．2 检测方法：采用酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay，ELISA)检测各细胞因子和TLRs的表达水平。IL-2、IL-4、TNF-α、TLR-4、TLR-9 ELISA检测试剂盒分别购自R&D System公司。实验操作步骤按照ELISA试剂盒说明进行。主要操作步骤包括：取出96孔板，加50 μL依次稀释的标准品于相应的反应孔中，制备标准曲线。加50 μL待检样品于反应孔中。每个样品做3个复孔。洗板5次，即弃去液体，甩干，每孔加满稀释后洗涤液，振荡30 s，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。如此重复5次，拍干。每孔加入酶标试剂50 μL，空白孔除外。轻轻晃动混匀，37 ℃温育30 min。洗板5次。每孔先加入显色剂A 50 μL，再加入显色剂B 50 μL，轻轻震荡混匀，37 ℃避光显色10 min。取出酶标板，每孔加终止液50 μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)。以空白孔调零，在450 nm波长下应用Labsystem Version1.3.1 酶标仪测量各孔的吸光度值(OD值)。 测定应在加终止液后15 min内进行。根据标准品的浓度及对应的OD值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的OD值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

2 结果

2．1 TLR-4、TLR-9检测 应用ELISA法检测Toll样受体(TLRs)TLR-4和TLR-9在不同程度HIE患儿血清中的表达。各组HIE患儿TLR-4和TLR-9分别与正常对照组比较，轻度HIE患儿组TLR-4表达量有所增加，但与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。中度和重度HIE患儿组中TLR-4表达量明显增加，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着病情的严重程度增加，TLR-4表达量增加更加明显(P<0.01)。TLR-9在不同程度HIE患儿组中表达量变化与TLR-4相似，即在轻度HIE患儿组中表达增加，与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。但在中度和重度HIE患儿中TLR-4表达量明显增加，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 不同程度HIE患儿血清TLRs表达变化

注：与对照组比较，*P<0.05；与对照组比较，**P<0.01

2．2 HIE患儿细胞因子表达变化 轻度HIE患儿组IL-2表达量略降低，但与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。中度和重度HIE患儿组中IL-2表达量明显增加，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着病情的严重程度增加，IL-2增加更加明显(P<0.01)。IL-4在轻度和中度HIE患儿组中表达量无明显变化，与正常对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。但在重度HIE患儿的IL-4表达量明显降低，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)。而TNF-α在不同程度HIE患儿组中的表达与IL-2表达类似，区别于IL-4，各组HIE患儿血清中可检测到TNF-α表达增加，与对照组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，且随着病情的严重程度，TNF-α增加更加明显(P<0.01)。见表2。

表2 不同程度HIE患儿血清细胞因子表达变化

注：与对照组比较，*P<0.05；与对照组比较，**P<0.01

3 讨论

新生儿由于免疫功能发育不完善，易受到包括低体质量、窒息、早产、宫内感染等多种因素影响，因此新生儿期是敏感时期。如新生儿在围生期由于母胎血气交换障碍，导致新生儿血氧浓度降低，易发生新生儿窒息，进而引发HIE，重者遗留严重的神经系统后遗症[5]。随着对新生儿免疫机制的研究不断深入，探索HIE免疫因素相关发病机制日益受到重视。

TLRs是一大类能识别病原体的模式分子，识别病原微生物高度保守的PAMPs，激活特异性信号转导途径，连接机体固有免疫应答与适应性免疫应答，不仅可以活化固有性免疫应答，还可引起细胞因子释放，上调并刺激分子的表达，而进一步刺激并活化获得性免疫应答。在机体抗感染过程中发挥极为重要的作用。TLRs分子具有不同的识别谱，入侵病原体不同，引发一个或多个TLRs家族成员表达变化，免疫系统借此区别入侵的病原微生物，产生不同的细胞因子，诱导不同免疫应答形式清除病原体[6-7]。虽然近年研究中有TLRs在缺血缺氧性脑损伤中的报道[8-10]，但针对新生儿HIE的报道少见。

TLR-4分布广泛，对革兰阳性菌的肽聚糖、磷酸和革兰阴性菌的鞭毛蛋白具有识别作用。既往研究证实，TLR-4在小鼠缺氧缺血性脑病中表达上调[9]。本研究得到类似结果，证实在不同程度新生儿HIE中相应TLR-4表达增加，虽病情严重程度增加，表达增加更加明显。TLR9是近年研究较多的TLRs家族成员，但对TLR-9在缺氧缺血性脑病中表达尚未见相关报道。本研究表明，TLR-9在不同程度新生儿HIE中表达增加，且与病情严重程度呈正相关。我们进一步检测了TLRs的相关细胞因子IL-2、IL-4、TNF-α的表达情况，结果发现，各组HIE患儿IL-2和 TNF-α表达增加，而IL-4在轻度和中度HIE患儿组中表达量无明显变化，但在重度HIE患儿的IL-4表达量明显降低。

Th1/Th2细胞由Th0细胞分化而来，Th0细胞的分化方向受抗原的性质(如不同的微生物)、局部环境及细胞因子及细胞内关键转录因子调控，如细胞因子IL-12、干扰素，转录因子STAT1、STAT4、IRF1促使Th0向Th1细胞分化。细胞因子IL-4、IL-10，转录因子STAT6、IRF4和GATA-3促使Th0向Th2细胞分化。Th1类细胞主要分泌IL-2、IFN-γ、TNF-α等细胞因子，介导细胞免疫；Th2类细胞主要分泌IL-4、IL-10等，介导体液免疫。Th1和Th2之间相互调节，相互制约，处于动态平衡，因此可以维持机体正常的细胞免疫和体液免疫。Th1/Th2细胞平衡的失调尤其Th1细胞的数量增加和功能亢进可能加剧了其炎症的发生和发展[11]。Th1和Th2细胞因子互相抑制彼此表型的分化和功能，即Th1型细胞因子的产生可下调Th2型免疫应答，反之亦然。

本研究发现，新生儿HIE可引起TLRs表达增加，IL-2、TNF-α等Th1细胞因子上调明显，占明显优势，而TLR9也以诱导Th1免疫反应为主。作为Th2分泌的细胞因子——IL-4表达降低。因此，新生儿HIE可能激发Th1诱导的细胞免疫应答为主，而TLR-4、TLR-9作为靶标治疗可能缓解新生儿HIE的发生和发展。

[1] Nestaas E，Skranes JH，Støylen A，et al．The myocardial function during and after whole-body therapeutic hypothermia for hypoxic-ischemic encephalopathy，a cohort study[J]．Early Hum Dev，2014，90(5)：247-252．

[2] Khan RH，Islam MS，Haque SA，et al．Correlation between grades of Intraventricular Hemorrhage and severity of hypoxic ischemic encephalopathy in perinatal asphyxia[J]．Mymensingh Med J，2014，23(1)：7-12．

[3] Templeton JP，Freeman NE，Nickerson JM，et al．Innate immune network in the retina activated by optic nerve crush[J]．Invest Ophthalmol Vis Sci，2013，54(4)：2 599-2 606．

[4] Reardon C，Duncan GS，Brüstle A，et al．Lymphocyte-derived ACh regulates local innate but not adaptive immunity[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2013，110(4)：1 410-1 415．

[5] Patel SD，Pierce L，Ciardiello AJ，et al．Neonatal encephalopathy：pre-clinical studies in neuroprotection[J]．Biochem Soc Trans，2014，42(2)：564-568．

[6] Marsh B，Stevens SL，Packard AE，et al．Systemic lipopolysaccharide protects the brain from ischemic injury by reprogramming the response of the brain to stroke：a critical role for IRF3[J]．J Neurosci，2009，29(31)：9 839-9 849．

[7] Mas＇lińska D，Laure-Kamionowska M，Mas＇liński S．Toll-like receptors in rat brains injured by hypoxic-ischaemia or exposed to staphylococcal alpha-toxin[J]．Folia Neuropathol，2004，42(3)：125-132．

[8] Hickey E，Shi H，Van Arsdell G，et al．Lipopolysaccharide-induced preconditioning against ischemic injury is associated with changes in toll-like receptor 4 expression in the rat developing brain[J]．Pediatr Res，2011，70(1)：10-14．

[9] Salama M，Farrag SM，abulasrar SA，et al．Up-regulation of TLR-4 in the brain after ischemic kidney-induced encephalopathy in the rat[J]．CNS Neurol Disord Drug Targets，2013，12(5)：583-586．

[10] Stridh L，Mottahedin A，Johansson ME，et al．Toll-like receptor-3 activation increases the vulnerability of the neonatal brain to hypoxia-ischemia[J]．J Neurosci，2013，33(29)：12 041-12 051．

[11] Osakwe CE，Bleotu C，Chifiriuc MC，et al．TH1/tH2 cytokine levels as an indicator for disease progression in human immunodeficiency virus type 1 infection and response to antiretroviral therapy[J]．Roum Arch Microbiol Immunol，2010，69(1)：24-34．

(收稿2015-10-05)

R722.1

A

1673-5110(2016)19-0051-03