槲皮素对丙泊酚麻醉术后小鼠认知功能的影响及其机制

冯艳，魏芳

槲皮素对丙泊酚麻醉术后小鼠认知功能的影响及其机制

冯艳，魏芳

（大连医科大学附属第一医院麻醉科，辽宁 大连 116011）

目的研究槲皮素对丙泊酚麻醉诱导的术后认知功能障碍（POCD）的影响，并初步探讨其作用机制。方法槲皮素灌胃预处理10月龄小鼠2周后，进行丙泊酚麻醉和腹腔探查术，术后继续槲皮素灌胃处理1周（槲皮素组），同时设置对照组、麻醉组（丙泊酚麻醉）、手术组（丙泊酚麻醉后行腹腔探查术）。应用Morris水迷宫测定小鼠处理前后的定位航行能力和空间探索能力；分别应用实时PCR和Western blot检测小鼠海马晚期糖基化终末产物受体（RAGE）mRNA和蛋白表达水平。结果与对照组相比，麻醉组和手术组小鼠逃避潜伏期明显延长（P＜0.05），原平台停留时间百分比明显下降（P＜0.05），且手术组变化更为明显；槲皮素组与对照组相比，小鼠Morris水迷宫测试结果无明显差异。与对照组相比，麻醉组和手术组小鼠RAGEmRNA和蛋白表达水平均显著增高（P＜0.05），而槲皮素组变化不明显。RAGEmRNA及蛋白表达水平与逃避潜伏期呈正相关，与原平台停留时间百分比呈负相关。结论槲皮素可改善丙泊酚麻醉诱导的POCD，该作用可能与抑制RAGE表达有关。

槲皮素；丙泊酚；术后认知功能障碍；晚期糖基化终末产物受体

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随着人类预期寿命逐步提高，我国人口老龄化已逐步显现，接受手术治疗的老年人群逐年增加。术后认知功能障碍（postoperative cognitive dysfunc⁃tion，POCD）为老年人术后常见并发症，轻者仅表现为认知异常，中重度则会出现记忆受损，判断能力和语言概括能力减弱，甚至痴呆。POCD虽然不会明显影响患者外科疾病病程，但会造成患者生活质量下降，延长住院时间，增加医疗成本［1⁃2］。除与手术创伤、中枢神经系统慢性同发病、手术持续时间、术中出血量等相关外，目前认为POCD与麻醉尤其全麻的关系非常密切［3⁃4］。有研究［5］显示，全麻术后3 d，POCD发生率在65%左右。

丙泊酚是目前临床上最常用的静脉麻醉药之一，广泛用于麻醉诱导与维持、重症患者镇静、门诊小手术和内镜检查等短时间麻醉。大剂量应用丙泊酚常导致患者发生POCD［6⁃8］，目前尚无有效的防治措施。槲皮素是一种多羟基黄酮类化合物，具有抗氧化、抗癌、抗感染、抗炎、降糖降压、免疫调节多种药理作用［9］。近年研究显示，槲皮素还具有显著改善学习记忆的功能［10⁃12］。晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end product，RAGE）是一种具有多种重要功能的多配体膜受体，新近研究显示海马RAGE表达上调可能在丙泊酚麻醉导致的POCD中发挥重要作用［13⁃14］。因此，本研究采用老龄小鼠，探讨槲皮素对因丙泊酚全麻后手术诱导POCD的作用及其与RAGE表达的关系。

1　材料与方法

1.1实验动物

10月龄雄性昆明种小鼠80只，体质量24～28 g，由中国医科大学实验动物中心提供。小鼠编号后，按随机数字法随机分组，每组20只，共4组，包括阴性对照组（对照组）、丙泊酚麻醉组（麻醉组）、丙泊酚麻醉手术组（手术组）、丙泊酚麻醉手术后槲皮素处理组（槲皮素组）。

1.2处理前水迷宫训练

应用Morris迷宫（北京硕林苑生物科技有限公司）训练80只小鼠，每天2次，共训练5 d。第5天训练结束后，测定每只小鼠的逃避潜伏期（即定位航行能力）以及原平台所在象限停留时间百分比（即空间探索能力）。

1.3模型建立与药物处理

Morris水迷宫训练结束后，对照组、麻醉组、手术组小鼠正常饲养，槲皮素组小鼠在正常饲养的基础上灌胃给予槲皮素（MB1938，大连美仑生物技术有限公司）1 mg/10 g体质量，每日1次。2周后，对照组小鼠腹腔注射生理盐水0.1 mL/10 g体质量；麻醉组小鼠腹腔注射相同体积丙泊酚（D126608，美国Sigma⁃Aldrich公司）1 mg/10 g体质量；手术组小鼠在腹腔注射同剂量丙泊酚产生麻醉效应后，进行腹腔探查术，术后进行抗感染处理；槲皮素组在丙泊酚麻醉并进行腹腔探查术后次日开始，继续灌胃给予槲皮素1 mg/10 g体质量，每日1次，共7 d。

1.4认知功能评价

槲皮素给药结束后，应用Morris水迷宫测试各组小鼠定位航行能力和空间探索能力。

1.5小鼠海马组织RAGEmRNA及蛋白表达水平检测

Morris水迷宫测试结束后，颈椎脱位法处死小鼠，打开颅腔取出新鲜脑组织置于冰上，参照小鼠脑立体定位图谱，切取海马组织，-80℃保存，用于进一步检测。

提取各组海马组织总RNA并定量后，于M⁃MLV逆转录酶的作用下，以随机引物逆转录合成cDNA，反应条件为30℃10 min，50℃30 min，95℃5 min，4℃5 min。然后以cDNA产物为模板进行实时PCR扩增RAGE基因片段。RAGE上游引物5′⁃GTGGCTCGAATCCTCCCCAAT⁃3′，下游引物5′⁃CCTTCCCTCGCCTGTTAGTTG⁃3′；GAPDH上游引物5′⁃GTTAGTGGGGTCTCGCTCTG⁃3′，下游引物5′⁃GGCAAATTCAACGGCACA⁃3′；反应条件：95℃5 min后，按照95℃30 s，58℃45 s，72℃30 s，进行35个循环。实验重复3次，应用2-ΔΔCT法计算海马组织中RAGEmRNA表达水平。

提取海马总蛋白并定量后，每例样本各取30 μg蛋白样品进行10%SDS⁃PAGE电泳，并将目的蛋白条带转移在PVDF膜上。PVDF膜经5%脱脂奶粉封闭后，加入兔抗RAGE多克隆抗体（1∶1 000稀释，ab30381，上海Abcam）4℃孵育过夜，次日洗膜后，二抗（1∶1 000稀释，BA1080，武汉博士德生物工程有限公司）室温孵育2 h，洗膜后用ECL化学发光法检测RAGE蛋白表达，同一样本重复3次，以条带灰度值进行分析。

1.6统计学分析

各组小鼠间学习记忆能力、RAGEmRNA和蛋白表达水平等变量均采用表示，采用SPSS 16.0统计学软件，对各组间上述变量进行单因素方差分析，应用Pearson相关分析对上述变量间的相关性进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1槲皮素对丙泊酚麻醉术后小鼠认知功能的影响

应用Morris水迷宫测定各组小鼠在处理因素施加前后定位航行能力（表1）。结果发现，实验前小鼠定位航行试验的逃避潜伏期各组间无统计学差异；实验后，与对照组和槲皮素组相比，麻醉组和手术组的潜伏期明显增加（P＜0.05）；与实验前相比，实验后对照组和槲皮素组潜伏期无明显变化，而麻醉组和手术组潜伏期明显增加（P＜0.05），并且手术组增加更明显。

表1　槲皮素对丙泊酚麻醉术后小鼠定位航行试验逃避潜伏期的影响Tab.1　Effects of quercetin on the escape latency of mice after propofol anesthesia

应用Morris水迷宫测定各组小鼠在处理因素施加前后空间探索能力（表2）。结果发现，实验前小鼠原平台停留时间百分比各组间无统计学差异；实验后，与对照组和槲皮素组相比，麻醉组和手术组的原平台停留时间百分比明显减少（P＜0.05）；与实验前相比，实验后对照组原平台停留时间百分比无明显变化，而麻醉组、手术组和槲皮素组原平台停留时间百分比明显降低（P＜0.05），并且手术组降低最明显，槲皮素组降低幅度最小。

表2　槲皮素对丙泊酚麻醉术后小鼠空间探索试验原平台停留时间百分比的影响Tab.2　Effects of quercetin on the percentage of the primary platform in the space exploration experiment of mice af⁃ter propofol anesthesia

2.2槲皮素对丙泊酚麻醉术后小鼠海马组织中RAGEmRNA表达水平的影响

实时PCR扩增结果显示，与对照组小鼠相比，麻醉组和手术组小鼠海马组织中RAGEmRNA表达水平显著升高（P＜0.05），且手术组RAGEmRNA表达水平较麻醉组显著升高（P＜0.05）；槲皮素组小鼠RAGEmRNA表达水平较对照组无显著变化，且比麻醉组和手术组显著降低（P＜0.05）。见表3。

表3　槲皮素对丙泊酚麻醉术后小鼠海马组织中RAGE mRNA和蛋白表达水平的影响Tab.3　Effects of quercetin on the expression of RAGE mRNA and protein in the hippocampus of mice after propofol anesthesia

2.3槲皮素对丙泊酚麻醉术后小鼠海马组织中RAGE蛋白表达水平的影响

Western blot结果显示，与对照组小鼠相比，麻醉组和手术组小鼠海马组织中RAGE蛋白表达水平显著升高（P＜0.05），且手术组RAGE蛋白表达水平较麻醉组显著升高（P＜0.05）；槲皮素组小鼠RAGE蛋白表达水平较对照组无显著变化，且比麻醉组和手术组显著降低（P＜0.05）。见表3，图1。

图1　丙泊酚麻醉术后小鼠海马组织中RAGE蛋白的表达Fig.1　Expression of RAGE protein in the hippocampus of mice after propofol anesthesia

2.4小鼠认知功能与海马RAGE表达水平的相关性

全部80只小鼠施加处理因素后，应用Pearson相关分析对定位航行试验逃避潜伏期及空间探索试验原平台停留时间百分比与海马组织中RAGE mRNA及蛋白表达水平的相关性进行分析。结果显示，RAGE蛋白表达水平与逃避潜伏期呈正相关（r=0.276，P=0.034），与原平台停留时间百分比呈负相关（r=-0.299，P=0.031）。

3　讨论

本研究以10月龄老龄雄性小鼠为研究对象，通过灌胃给予槲皮素预处理2周后，进行丙泊酚麻醉并施行腹腔探查术（以模拟丙泊酚麻醉手术老年患者），并继续给予槲皮素1周后，检测小鼠的认知功能。本研究发现，与腹腔注射生理盐水的对照组相比，腹腔注射丙泊酚的麻醉组以及麻醉后施行腹腔探查术的手术组小鼠的认知功能明显降低，表现为Morris水迷宫定位航行试验逃避潜伏期明显延长，而空间探索试验原平台停留时间百分比明显下降，并且手术组变化更为明显。这与已有研究结果一致，说明丙泊酚麻醉手术可引起POCD。而槲皮素组小鼠Morris水迷宫检测中表现的记忆认知功能明显改善。已有研究［10⁃12］发现槲皮素可改善糖尿病大鼠、D⁃半乳糖衰老模型小鼠、因高脂膳食诱导的学习记忆能力受损小鼠等动物模型的学习记忆能力，本研究结果进一步验证了槲皮素具有改善认知功能的作用，并且首次观察到对丙泊酚麻醉诱导的POCD的改善作用。

槲皮素改善认知功能的机制尚不完全清楚，早期研究认为可能与抗氧化活性相关。毛海芬等［11］认为槲皮素可以增加海马促生长因子的含量，修复受损的突触结构，上调突触数量，从而改善糖尿病大鼠的学习记忆能力；而孙红等［13］认为槲皮素可改善脑组织氧化还原状态，上调脑源性神经生长因子的表达，从而改善小鼠的认知功能。鉴于王君艳等［14］发现RAGE上调在丙泊酚诱导的POCD发挥重要作用，本研究检测了小鼠海马组织中RAGE mRNA和蛋白表达水平，结果发现，与对照组相比，麻醉组和手术组小鼠RAGEmRNA和蛋白表达水平均显著增高，而槲皮素组该变化则被抑制。同时分析小鼠认知功能与海马RAGE表达水平的相互关系，发现RAGE蛋白表达水平与逃避潜伏期呈正相关，与原平台停留时间百分比呈负相关，这提示槲皮素改善丙泊酚诱导的POCD作用可能是通过抑制RAGE表达实现的。已有研究［15］报道，槲皮素脂质体可减少糖尿病大鼠肾脏RAGE表达，而发挥对糖尿病大鼠肾脏的保护作用，并且槲皮素可下调糖尿病大鼠视网膜RAGEmRNA表达水平。本研究结果与上述报道一致。

综上，本研究结果提示槲皮素可改善丙泊酚麻醉诱导的POCD，该作用可能与抑制RAGE表达有关。

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（编辑陈姜）

Effect and Mechanism of Quercetin on Cognitive Function in Mice after Propofol Anesthesia

FENG Yan，WEI Fang
（Department of Anesthesia，The First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian 116011，China）

ObjectiveTo investigate the effect of quercetin on the postoperative cognitive dysfunction（POCD）induced by propofol anesthesia，and further explore the mechanism of this effect.MethodsThe mice were randomly divided into control group（normal feeding），anesthesia group（propofol），operation group（abdominal exploration after propofol anesthesia），and quercetin group.In quercetin group，the mice were pre⁃treated with quercetin by irrigation gastric for 2 weeks，then narcotized with propofol and underwent exploratory laparotomy，following with querce⁃tin treatment for 1 week.Morris water maze was used to determine the ability of positioning navigation and space exploration of mice.Advanced gly⁃cation end products receptor（RAGE）mRNA and protein expression levels were detected by real⁃time PCR and Western blot，respectively.Re⁃sults Compared with the control group，mice in anesthesia group and operation group exhibited significantly prolonged escape latency（P＜0.05），and the original platform residence time percentage decreased significantly（P＜0.05）.In addition，the changes in the surgical group is more obvi⁃ous.Quercetin group mice showed no significant difference compared to control group in the Morris water maze test.RAGEmRNA and protein ex⁃pression levels of anesthesia group and operation group mice were significantly increased（P＜0.05）compared to control group，but not obviously in quercetin group.RAGEmRNA and protein expression levels were positively correlated with escape latency，but negatively correlated with the original platform residence time percentage.ConclusionQuercetin can improve the POCD induced by propofol anesthesia，which may be related to the inhibition of RAGE expression.

quercetin；propofol；postoperative cognitive dysfunction；advanced glycation end products receptor

R614.2

A

0258-4646（2016）09-0801-04

10.12007/j.issn.0258⁃4646.2016.09.008

辽宁省省直医院改革重点临床科室诊疗能力建设项目（LNCCC⁃C06⁃2015）

冯艳（1982-），女，主治医师，硕士研究生.

魏芳，E-mail：wf⁃cmh@163.com

2016-06-22

网络出版时间：