PVDF微孔滤膜负载金纳米粒子用于牛奶中三聚氰胺的SERS快速检测

曾甜,陈钱,江茜,周吉,叶勇

(有机化工新材料湖北省协同创新中心,湖北大学有机功能分子合成与应用教育部重点实验室,武汉 430062)



PVDF微孔滤膜负载金纳米粒子用于牛奶中三聚氰胺的SERS快速检测

曾甜,陈钱,江茜,周吉*,叶勇

(有机化工新材料湖北省协同创新中心,湖北大学有机功能分子合成与应用教育部重点实验室,武汉 430062)

本文报道了一种利用聚偏二氟乙烯(Polyviny Lidene Fluoride,PVDF)微孔滤膜为载体的三聚氰胺(Melamine,MAM)的简便快速痕量分析技术。通过柠檬酸钠还原法制得平均粒径为30 nm的纳米金溶胶,加入不同浓度的三聚氰胺后金纳米粒子快速聚集,这种纳米金聚集体可以通过简便快捷的过滤技术截留在PVDF微孔滤膜表面,进而用于SERS检测,在水溶液中最低检测浓度为0.05 mg/L。我们进一步在牛奶样品中进行检测,在牛奶中检测限可以达到1 mg/L,满足大部分国家规定的婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值为1 mg/kg的参考标准。该分析方法制备过程简单、成本低廉、总分析时间短,易于实现现场快速灵敏检测,应用前景广阔。

表面增强拉曼散射；PVDF微孔滤膜；金纳米粒子；三聚氰胺

1 引言

三鹿奶粉掺加三聚氰胺事件,引起了整个社会的关注。三聚氰胺分子中含有大量的氮,用普通凯氏定氮法测定奶制品中蛋白质含量时,无法区分氮元素是来源于蛋白质分子还是三聚氰胺。目前,已经有许多方法可以用于准确的检测食品中三聚氰胺的含量,例如酶联免疫吸附分析法(ELISA)[1]、质谱法[2]、液相色谱法[3]、表面增强拉曼光谱(SERS)[4-8]、比色法[9]等等。然而,这些方法或多或少都存在着一些不完美之处,比如需要进行较长时间的样品前处理、复杂的目标分子分离步骤、检测限不够低、检测时间长等等。所以,仍然有必要建立起一种快速、简单、高效的痕量分析方法,用于监控牛奶的质量安全。

SERS技术作为一种高效的分析检测手段,具有灵敏度高、选择性好、检测范围广、快速、原位分析等优点,已成功应用在分析化学、环境化学、食品化学和生物检测等众多领域[10]。现场快速痕量分析应用是SERS技术近年来最重要的发展方向之一。而要实现对样品的现场检测,必须有与之相匹配的SERS 基底。这样的SERS 基底必须满足以下条件：一是简单、易操作；二是重现性与稳定性好；三是检测灵敏度高；四是性价比高,经受住市场的考验。纸质SERS 基底[11-13]具备薄、轻、储存能力大、制作工艺简单、样品采集容易、便于携带、低成本、可批量生产、容易吸附与富集待测分子等特点和优势,有望成为最佳选择。

本文报道了一种利用PVDF微孔滤膜为载体的三聚氰胺的简便快速痕量分析技术。向纳米金溶胶中加入不同浓度三聚氰胺后金纳米粒子快速聚集,这种纳米金聚集体可以通过简便快捷的过滤技术截留在PVDF微孔滤膜表面,进而构建了SERS分析检测平台,在水溶液中最低检测浓度为0.05 mg/L。我们还进一步考察了该方法在实际牛奶样品检测中的应用,实验结果表明该方法对实际牛奶样品中三聚氰胺含量的检测限为1 mg/L,符合大部分国家对婴幼儿奶粉中三聚氰胺含量要求的最低标准,是一种检测实际样品中三聚氰胺含量的快速痕量分析方法。

2 实验部分

2.1 实验材料

氯金酸(AuCl3·HCl·4H2O)、柠檬酸三钠(C6H5Na3O7·2H2O)均购自国药集团化学试剂有限公司；三聚氰胺(melamine,MAM)购自阿拉丁试剂有限公司；新鲜的牛奶购自当地超市；实验用水为经过产自美国Millipore公司的Milli-Q净水系统处理后得到的去离子水；聚四氟乙烯微孔滤膜(PVDF durapore membrane,孔径为0.45m)购自Millipore公司；聚碳酸酯支架购自Cole Parmer公司。

2.2 仪器与参数设置

金纳米粒子溶胶的紫外-可见吸收光谱(UV-Vis)由美国必达泰克公司的BRC642E CCD 阵列光谱仪获得；修饰纳米粒子前后PVDF膜表面形貌由日本电子JSM6510LV扫描电子显微镜(SEM)表征；膜过滤过程采用保定兰格恒流泵有限公司的多通道注射泵完成；拉曼光谱使用英国Renishaw公司Invia型共聚焦显微拉曼光谱仪测量(仪器分辨率为1 cm-1,激发光源为He-Ne激光器,激光波长为633 nm,激光器最大输出功率为17 mW,共聚焦显微系统为德国Leica公司DMLM 型显微镜,配备50、25、5 倍三个物镜,激光经过50 倍物镜聚焦后,光斑直径大小为1m,所有拉曼数据均为10 s 累积1次的结果。

2.3 PVDF微孔滤膜用于SERS分析载体

将PVDF圆片膜封闭于聚碳酸酯滤膜支架中,用一个1 mL的注射器吸入一定量的三聚氰胺与金溶胶的混合溶液,设定一定的流速匀速推动注射器使混合溶液缓慢通过PVDF圆片膜,由于纳米金聚集体尺寸大于微孔滤膜的孔径,吸附有三聚氰胺的金纳米聚集体停留在PVDF膜表面,另一端流出无色透明溶液,小心取出圆片膜在40℃下烘干,然后直接进行SERS检测。膜的修饰过程如图1所示。

3 结果与讨论

3.1 三聚氰胺诱导金纳米粒子聚集的紫外表征

在金纳米粒子的合成过程中,柠檬酸钠既是还原剂又是阻碍金纳米粒子聚集的稳定剂,当加入三聚氰胺后,氨基会与柠檬酸根结合,降低了金纳米粒子之间的静电排斥作用,从而导致金纳米粒子发生聚集。图2A为不同浓度MAM加入金溶胶后颜色变化的光学照片,可以看出,随着MAM浓度增大,Au纳米溶胶颜色逐渐变紫,出现明显聚集。图2B为加入不同浓度MAM后的金纳米粒子的紫外图谱。从图中可以看到,所制备的金纳米粒子紫外吸收峰位置在526 nm处,与文献报道的30 nm粒径的金纳米粒子吸收峰位置基本一致。加入MAM后,金溶胶的最大吸收峰降低,且在750 nm处出现新的吸收峰,随着MAM的浓度逐渐增大,新吸收峰的高度逐渐增加,位置发生红移,进一步说明加入MAM后能够引起金溶胶的快速聚集。

Fig.1 The SERS approach is created simply by passing the aggregated MAM-Au colloid solution through a filter membrane using a syringe

Fig 2 (A) Visual colour change of Au NPs with the indicated concentrations of melamine.(B) The evolution of UV-vis absorbance spectra of Au NPs colloid with the melamine concentration from 0,0.05,0.1,1.0,10,50,to 100 mg/L

3.2 修饰纳米粒子后PVDF微孔滤膜表面形貌表征

PVDF膜,膜基质具有大表面积、高渗透性及高吸附性能等显著优点,被广泛用于蛋白质印迹、环境污水处理等领域。由图3A可见,PVDF膜表面均匀,可见微孔的存在。将一定量的三聚氰胺与金溶胶的混合溶液匀速推过PVDF膜后,流出溶液为无色,说明金纳米聚集体被截留在PVDF膜表面,如图3B所示,高密度的纳米金聚集体分布在纤维结构表面,这也是后续能产生明显SERS增强的原因。

Fig.3 SEM images of (A) bulk PVDF filter membrane and (B) showing the clustering of gold nanoparticles in the pores of the filter membrane

3.3 在溶液中和牛奶中检测三聚氰胺

Fig.4 SERS spectra of (A) melamine in aqueous solution detected using filter SERS.(B) melamine from real milk samples detected using filter SERS.The percentages of melamine in milk were 100 mg/L,10 mg/L and 1 mg/L

通过三聚氰胺的水溶液样品验证完该方法的检测能力之后,我们选择添加不同量三聚氰胺分子的新鲜牛奶作为实验样品,完成了对实际样品中三聚氰胺分子的含量分析。首先我们向4.5 mL新鲜牛奶中分别添加0.5 mL不同浓度(1000、100、10 mg/L)的三聚氰胺标准溶液,混匀后即得到100、10、1 mg/L三聚氰胺加标牛奶样品,将该牛奶样品进行离心处理后(以10000转每分钟的速度离心20分钟),取上清液作为后续实验的待测样品。离心过程中,可将牛奶中的蛋白质、脂肪等较大的生物分子分离出来,以免这些大生物分子会在后续的检测过程中吸附到PVDF膜表面,影响对三聚氰胺的SERS检测。按照前面所述的操作方法,我们获得了掺有不同量三聚氰胺的牛奶样品的测试结果,如图4B所示。三聚氰胺的特征峰的强度随牛奶中的三聚氰胺的添加量的降低而减弱,根据三聚氰胺含量为1 mg/L的牛奶样品的测量结果大于三倍空白样品的标准偏差的原则,我们判断该方法对牛奶中三聚氰胺的SERS分析的检测限可以达到1 mg/L。这一检测限正好符合2011年由国家工商行政管理局和国家质量监督检验检疫总局联合颁布的关于食品中三聚氰胺含量规范的公告：“婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值为1 mg/kg,其它食品中三聚氰胺的限量值为2.5 mg/kg,高于上述限量的食品一律不得销售”。

4 结论

本文建立了一种简单快速的牛奶中三聚氰胺检测的方法。以PVDF微孔滤膜为载体,采用简单过滤的方法将三聚氰胺诱导的金纳米聚集体截留在PVDF膜表面,进而实现三聚氰胺的痕量SERS检测。实验结果表明,由于微孔滤膜固有的吸附富集性能,对牛奶中痕量三聚氰胺具有较好的检出,检测限可以达到1 mg/L,满足大部分国家规定的婴儿配方食品中三聚氰胺的限量值为1 mg/kg的参考标准。由于整个实验过程不需要繁琐的提取和分离步骤,大大的减少了对三聚氰胺的测试时间,表明该方法将在现场痕量分析方面具有较大应用潜力。

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Rapid Detection of Melamine in Milk by Surface-Enhanced Raman Spectroscopy with PVDF Membranes as Supports

ZENG Tian,CHEN Qian,JIANG Qian,ZHOU Ji*,YE Yong

(HubeiCollaborativeInnovationCenterforAdvancedOrganicChemicalMaterials,MinistryofEducationKeyLaboratoryfortheSynthesisandApplicationofOrganicFunctionMolecules,HubeiUniversity,Wuhan430062,P.R.China)

We demonstrate an extremely simple and practical surface-enhanced Raman spectroscopy (SERS) technique for trace melamine detection in milk with PVDF(Polyviny Lidene Fluoride) membranes as supports.Through trisodium citrate reduction method,gold nanoparticles with average diameter of 30 nm were obtained.Upon addition to trace-level melamine,gold nanoparticle solution exhibits a highly sensitive colour change from red to blue and rapid aggregation behavior within several minutes.The SERS detection platform was constructed after trapping the mixture of aggregates and melamine on PVDF membrane through a simple filter-based approach,and the lowest detectable concentration was 0.05 mg/L in aqueous solution.Moreover,for the melamine-spiked milk samples,the lowest detectable concentration was 1 mg/L,which could meet the requirement accepted by most countries that the threshold in infant formula was 1 ppm.Thus,due to the simple procedure,the low-cost of the substrates and the short total analysis time,our technique enables SERS to be practical for a broad range of analytical applications,including field-based detection of toxins in large volume samples.

surface enhanced Raman spectroscopy；PVDF membrane；Au nanoparticle；melamine

2015-07-15; 修改稿日期:2015-11-20

国家自然科学基金(21003034)；湖北省教育厅团队项目(T201101)；湖北省教育厅青年人才项目(Q20131002)

曾甜(1990-),硕士,主研方向：表面增强拉曼光谱学 E-mail：852673807@qq.com

周吉,E-mail：zhouji@hubu.edu.cn

1004-5929(2016)03-0209-05

O657

A

10.13883/j.issn1004-5929.201603003