TPD52在胶质瘤中的表达水平及临床意义

高兵兵，秦 浩,秦家振,孙移坤,张昊驹,刘 晨，侯江雷，黄佛宝，罗 丹，戴宜武



TPD52在胶质瘤中的表达水平及临床意义

高兵兵1，秦 浩1,秦家振2,孙移坤2,张昊驹1,刘 晨2，侯江雷2，黄佛宝2，罗 丹2，戴宜武1

目的 探究TPD52在胶质瘤及正常脑组织中的表达及其临床意义。方法 收集46例胶质瘤患者病例标本及瘤旁正常脑组织，应用荧光定量PCR、Western blot、免疫组织化学染色方法检测TPD52 mRNA、蛋白的表达量，并分析临床指标与TPD52表达量之间的关系。结果 荧光定量PCR及Western blot结果具有一致性，均提示TPD52的表达量随胶质瘤病理分级升高，Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤TPD52表达量明显高于正常脑组织、Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤，差异有统计学意义(P<0.05)。免疫组织化学染色显示TPD52蛋白定位在胶质瘤细胞质中，67.4%病理标本高表达TPD52(或)。结论 TPD52 mRNA与蛋白在胶质瘤细胞中高表达，其蛋白表达量与胶质瘤病理分级呈正相关性，与生存期呈负相关性，其可能是胶质瘤临床治疗的一个潜在基因靶点。

胶质瘤；TPD52；病理分级；生存期

脑胶质瘤是发病率最高的颅内恶性肿瘤，约占中枢神经系统肿瘤的一半[1]，平均生存期仅为9～12个月[2]。虽然临床上“手术+放疗+化疗”[3]为主的综合治疗发挥到极致，但由于胶质瘤的浸润性、放疗的低敏感性、血脑屏障对化疗药物的阻隔性，患者预后仍未明显改善。因此，研究者把目光转向基因治疗，经过多年的探索，基因治疗有望成为人类战胜肿瘤的手段之一，而靶基因的筛选是基因治疗的核心。TPD52是近年来发现的一种原癌基因，其位于8q12染色体上，由200余个氨基酸组成[4]。TPD52基因被发现已有二十年，但对其作用的研究仍刚刚起步。目前为止，TPD52在胶质瘤的作用仍未被报道。该研究通过检测TPD52在原发恶性胶质瘤以及瘤旁正常脑组织中的表达水平，分析其在胶质瘤中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 病例资料 胶质瘤标本来源于2007年1月～2012年1月北京军区总医院附属八一脑科医院胶质瘤患者46例，其中男20例，女26例；年龄37～75(62.3±3.2)岁。按照WHO病理分级标准，经术后病理证实，其中Ⅰ级4例，Ⅱ级15例，Ⅲ级14例，Ⅳ级13例。随访时间为3年。病例纳入标准：① 患者均为原发胶质瘤且第一次行胶质瘤全切术；② 术后行规范化放疗加替莫唑胺化疗；③ 患者无其他恶性肿瘤、全身系统性疾病及免疫性疾病。病例排除标准：① 患者术后复发，再次手术；② 非正常死亡患者。

1.2 实验材料与试剂 一抗：人TPD52抗体购自英国Abcom公司(ab132140)；BCA蛋白分析试剂盒(北京康为世纪生物科技有限公司)；逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒(北京天根生物有限公司)；引物由生工生物(北京)工程有限公司合成。

1.3 免疫组化 胶质瘤标本用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片、脱蜡、水化，PBS冲洗3遍，3% H2O2阻断，PBS再次冲洗3遍，抗原修复，山羊血清封闭，加一抗(1 ∶1 000稀释)后4 ℃过夜，PBS冲洗3遍，滴加二抗后37 ℃孵育1 h，PBS冲洗3遍，加SP后37 ℃孵育30 min，DAB显色5 min，苏木精复染、脱水、透明、封片。通过阳性细胞染色率与染色浓度方式评估TPD52蛋白表达量。阳性细胞染色率得分：0(<5%,阴性)，1(5%～25%，弱阳性)，2(25%～50%，阳性)，3(>50%，强阳性)。细胞染色浓度得分：0(未染色)，1(淡黄色)，2(棕黄色)，3(棕褐色)。免疫组化最终得分等于阳性细胞染色率×细胞染色浓度，为0～9分。TPD52表达水平分为：-(0～1分)，+(2～3分)，(4～6分)，(7～9分)。病理样本分为：TPD52低表达组(TPD52-或TPD52+)，TPD52高表达组(TPD52或TPD52)。

1.4 TPD52 mRNA提取、逆转录与荧光定量PCR 取约60 g冻存脑组织研磨成粉，总RNA的提取采用TRIzol法，分光光度计测量总RNA在260/280下的浓度及纯度。然后，取1 μg总RNA，行逆转率得到cDNA。最后将cDNA适当稀释后行荧光定量PCR扩增评估TPD52表达水平，以β-actin作为内参基因。反应体系20 μl，包括2 μl cDNA、2×SYBR Premix Ex TaqⅡ、0.4 μl 50×ROX Reference Dye、各0.8 μl上下游引物、6 μl无菌离子水。循环参数设置如下：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，总共40个循环。引物序列如下：TPD52 上游引物:5′-TTCACAGGCAGGACAGAAAGA-3′,下游引物:5′-TTGAAGGTCGCAGAGTTCCT-3′;β-actin上游引物：5′-GTGGACATCCGCAAAGAC-3′,下游引物:5′-AAAGGGTGTAACGCAACTA-3′。采用2-ΔΔCt方法分析结果。

1.5 Western blot法检测蛋白表达量 从液氮中取出冰冻的组织标本，提取蛋白，BCA法测定蛋白浓度。8% SDS-PAGE胶电泳分离含25 μg的蛋白样品，将分离后的蛋白转移到PVDF膜，脱脂奶粉室温封闭1 h，加一抗TPD52(1 ∶1 000)、GAPHD(1 ∶2 000),4 ℃孵育过夜，TBST洗PVDF膜3遍，加二抗(1 ∶5 000)室温孵育1 h，再次TBSA洗PVDF膜3遍，显色。

1.6 统计学处理 采用SPSS 11.5软件进行分析，组间、组内比较采用t检验，TPD52蛋白表达量与患者年龄、性别的关系采用Spearman法分析，TPD52蛋白表达量与患者生存期的关系采用Kaplan-Meier方法。

2 结果

2.1 TPD52 mRNA在胶质瘤和正常脑组织中的表达水平 由于执行PCR扩增需要约60 g组织提取总mRNA，部分病理标本体积较小，无法从瘤旁正常脑组织提取足够的总mRNA，因此，选择其中35例来执行荧光定量PCR分析。经过对数据结果进行Ct值计算分析，瘤旁正常脑组织、胶质瘤组织ΔCt值分别为5.02±0.34、1.14±0.20，采用配对t检验方法，结果显示与瘤旁正常脑组织比较，TPD52 mRNA表达量在胶质瘤细胞中显著增高(P<0.01)。而且TPD52 mRNA表达量随胶质瘤病理分级升高而升高(图1)，Ⅰ～Ⅱ、Ⅲ～Ⅳ的ΔCt值分别为1.45±0.31、0.73±0.47，在Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中的表达量明显高于Ⅰ、Ⅱ级，表达差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 TPD52 mRNA在不同级别胶质瘤与瘤旁正常脑组织中的表达量

A：瘤旁正常脑组织；B：Ⅰ级胶质瘤；C：Ⅱ级胶质瘤；D：Ⅲ级胶质瘤；E：Ⅳ级胶质瘤

2.2 免疫组化结果 通过免疫组织化学染色显示在胶质瘤标本中TPD52蛋白主要定位在细胞质中。在不同级别的胶质瘤中TPD52蛋白表达均为阳性，其中31例(67.4%)高表达TPD52(或)，其余15例低表达TPD52(-或+),而瘤旁正常脑组织中仅5例低表达TPD52(-或+)，表达阳性率为10.8%，差异有统计学意义(P<0.05)。TPD52蛋白随胶质瘤病理分级升高而增高，Ⅰ级胶质瘤与Ⅱ级胶质瘤、Ⅲ级胶质瘤与Ⅳ级胶质瘤TPD52 蛋白表达差异无统计学意义，Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤中TPD52蛋白的表达量明显高于Ⅰ～Ⅱ胶质瘤中，差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

2.3 Western blot法检测蛋白量结果 TPD52蛋白表达量与TPD52 mRNA表达量具有一致性。与瘤旁正常脑组织比较，胶质瘤明显高表达TPD52蛋白(图3)。TPD52蛋白表达量随胶质瘤级别升高而增加。在Ⅳ级胶质瘤中表达量最高，Western blot条带灰度值最高，在正常脑组织中表达量最低，Western blot条带灰度值最低,TPD52蛋白在瘤旁正常脑组织、Ⅰ～Ⅱ胶质瘤、Ⅲ～Ⅳ级胶质瘤中表达量差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 TPD52 蛋白在不同级别胶质瘤中的表达量 免疫组化×200

图3 TPD52蛋白在4组配对胶质瘤与瘤旁正常脑组织中的表达

A：瘤旁正常脑组织；B：Ⅰ级胶质瘤；C：Ⅱ级胶质瘤；D：Ⅲ级胶质瘤；E：Ⅳ级胶质瘤

2.4 TPD52表达量与临床指标的关系 经对患者年龄、性别、WHO病理分级、生存期临床指标与TPD52蛋白表达量进行统计分析(表3)，结果显示年龄、性别与TPD52蛋白表达量差异无统计学意义，而病理分级与TPD52蛋白表达量呈正相关性，生存期与TPD52蛋白表达量呈负相关性，高表达TPD52蛋白患者(中位生存期11.74个月)比低表达TPD52蛋白患者(中位生存期23.32个月)生存期短，差异有统计学意义(P<0.05)(图4)。

表3 胶质瘤中TPD52表达量与临床指标的关系(n)

3 讨论

脑胶质瘤的发生发展是涉及多种基因相互作用的复杂过程，包括一系列突变基因的积累、原癌基因的激活、抑癌基因的失活。因此，基因治疗成为人类战胜肿瘤的手段之一，而靶基因的筛选是基因治疗的核心。

图4 TPD52表达量与患者生存期的关系

TPD52是一种原癌基因，由200余个氨基酸编码，位于8q12染色体上，这段区域在多种肿瘤中频繁扩增，与肿瘤的发生发展密切相关。TPD52被首先报道在乳腺癌[5]中过度表达。后续研究[6]显示TPD52在肺癌、前列腺癌、卵巢癌、B细胞淋巴瘤等恶性肿瘤中表达增高。

Chen et al[7]发现肺癌组织比正常肺组织中的TPD52表达增高，Lewis et al[8]进一步发现TPD52促进肺癌细胞的转化及转移。Wang et al[9]发现在前列腺癌中TPD52表达量升高，前列腺癌病理分级越高其表达量越高，且预示着差的术后生存期。Byrne et al[10]发现TPD52在卵巢癌中表达量同样升高，且与患者生存期呈负相关性。Ummanni et al[11]报道TPD52在乳腺癌中的高表达与不良的预后有关，且促进乳腺癌细胞的扩增、侵袭。以上这些研究结果，说明TPD52是恶性肿瘤发生发展一种生物标志物，可能是基因治疗的靶点。研究[7,9,11]表明TPD52在多种肿瘤组织中表达升高，与肿瘤分级、预后密切相关，参与肿瘤发生、扩增、浸润及转移等进程。Yang et al[12]敲除乳腺癌中TPD52基因后，发现这可以抑制乳腺癌细胞的增殖及集落形成，使细胞周期停留在G0/G1期，促进GSK3β磷酸化作用。Mirshahidi et al[13]经过对TPD52基因研究，对乳腺癌小鼠模型采取TPD52基因治疗后，可明显延长模型鼠生存期。进一步证实了TPD52在恶性肿瘤治疗中拥有广泛的前景。

目前国际上关于TPD52在肿瘤中的表达水平、临床意义及相关机制的报道仍很少，国内暂无此有关报道。本研究数据首次证实TPD52在胶质瘤组织中过度表达，瘤旁正常脑组织中不表达或少量表达，统计分析证实TPD52表达量与患者术后生存期呈负相关性。同时，本研究数据表明TPD52的表达量随病理分级升高而升高，这表明TPD52具有促进胶质瘤发生发展的作用。因此，TPD52可能是胶质瘤分化程度及术后生存期的分子生物学指标。

综上所述，推测TPD52对胶质瘤的发生、发展具有一定的影响和促进作用，可能是反应胶质瘤恶性程度和预后的标志物，这提示TPD52是胶质瘤临床治疗的一个潜在基因靶点，为在胶质瘤治疗的研究中提供了新的思路和基因靶点。由于肿瘤的发生、发展是多种基因相互的结果，TPD52在胶质瘤中具体机制尚不清楚，需要更深入的研究进行阐明。

[1] 程毅飞,张晓东,万 强,等.影响神经胶质瘤术后生存的相关因素分析[J].安徽医科大学学报,2014,49(8):1171-2.

[2] 马摇璐,余永强.T磁共振弥散张量纤维束成像对SD大鼠C6胶质瘤模型肿瘤生长特点随时间变化的影像学分析[J].安徽医科大学学报,2014,49(9):1233-7.

[3] Jackson M, Bydder S, Maujean E,et al.Radiotherapy in the manage-ment of high-grade gliomas diagnosed in Western Australia：a patterns of care study[J].J Med lmaging Radiat Oncol,2012,56(1):109-15.

[4] Lewis J D,Payton L A,Whitford J G,et al.Induction of tumorigenesis and metastasis by the murine orthologue of tumor protein D52[J].Mol Cancer Res,2007,5(2):133-44.

[5] Alkatout I,Friemel J,Sitek B,et al.Novel prognostic markers revealed by a proteomic approach separating benign from malignant insulinomas[J].Mod Pathol,2015,28(1):69-79.

[6] Tennstedt P,Bölch C,Strobel G,et al.Patterns of TPD52 overexpression in multiple human solid tumor types analyzed by quantitative PCR[J]. Int J Oncol,2014,44(2):609-15.

[7] Chen S L,Zhang X K, Halverson D O，et al.Characterization of human N8 protein[J].Oncoqene,1997,15(21):2577-88.

[8] Lewis J D,Payton L A,Whitford J G,et al.Induction of tumorigenesis and metastasis by the murine orthologue of tumor protein D52[J].Mol Cancer Res,2007,5(2):133-44.

[9] Wang R,Xu J,Mabjeesh N,et al.PrLZ is expressed in normal prostate development and in human prostate cancer progression[J].Clin Cancer Res,2007,13(20):6040-8.

[10]Byrne J A,Maleki S, Hardy J R,et al.MAL2 and tumor protein D52(TPD52) are frequently overexpressed in ovarian carcinoma,but differentially associated with histological subtype and patient outcome[J].BMC Cancer,2010,10:497.

[11]Ummanni R,Teller S, Junker H,et al.Altered expression of tumor protein D52 regulates apoptosis and migration of prostate cancer cells[J].FEBS J,2008,275(22):5703-13.

[12]Yang M,Wang X, Jia J，et al.Tumor protein D52-like 2 contributes to proliferation of breast cancer cells[J].Cancer Biother Radiopharm,2015,30(1):1-7.

[13]Mirshahidi S,Kramer V G,Whitney J B,et al.Overlapping synthetic peptides encoding TPD52 as breast cancer vaccine in mice:prolonged survival[J].Vaccine,2009,27(12):1825-33.

Expression level of TPD52 in gliomas and its clinical significance

Gao Bingbing1,Qin Hao1,Qin Jiazhen2，et al

(1AffiliatedBayiBrainHospitalofGeneralHospitalofBeijingMilitaryCommand,AnhuiMedicalUniversity,Beijing100000；2AffiliatedBayiBrainHospitalofGeneralHospitalofBeijingMilitaryCommand,Beijing100000)

ObiectiveToexploretheexpressionoftumorproteinD52(TPD52 )inhumangliomaandnormalbraintisseanditsclinicalsignificance.MethodsCollectingspecimensof46casesofgliomasandnormalbraintissueadjacenttotumours.TheexpressionofTPD52wasinvestigatedbyreal-timequantitativePCR,Westernblotandimmunohistochemistryingliomas.TherelationshipsbetwenTPD52espressionandclinicalfactorswereanalyzed.ResultsTheresultsofreal-timequantitativePCRandWesternblotshowedthattheexpressionofTPD52mRNAandproteinsignificantlyincreasedingliomatissuesascomparedwiththoseinnormalbraintissues．Immunohistochemistrydisplayedthat67.4%gliomatissuesexpressedhigherTPD52protein.ConclusionTheexpressionsofTPD52mRNAandproteinaresignificantlyhigheringliomathannormalbraintisse,andtheexpressionofTPD52proteinispositivelyassociatedwithgliomaWHOclassificationandnegativelyassociatedwithpatientslifetime.Itmaybeapotentialtargetgenestotreatgliomas.

glioma;TPD52;pathologicalgrade;lifetime

时间：2016-8-10 11:04:49

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.028.html

2016-05-19接收

国家自然科学基金(编号：81271391)

1安徽医科大学北京军区总医院附属八一脑科医院，北京 100000

2北京军区总医院附属八一医院脑科医院，北京 100000

高兵兵，男，硕士研究生；

戴宜武，男，教授，主任医师，博士生导师，责任作者，E-mail：dddyyywww@163.com

R 730.26

A

1000-1492(2016)10-1521-04

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.028