无创性延迟肢体缺血预适应对心脏性猝死的预防作用研究

李 燕，陈文华,2，孙 凯，张 颖，安梦瑶，潘莹莹，吴艳娜，康 毅，高卫真，娄建石

(1.天津医科大学基础医学院药理学系，天津 300070；2.宁夏医科大学总医院，宁夏 银川 750004)



无创性延迟肢体缺血预适应对心脏性猝死的预防作用研究

李 燕1，陈文华1,2，孙 凯1，张 颖1，安梦瑶1，潘莹莹1，吴艳娜1，康 毅1，高卫真1，娄建石1

(1.天津医科大学基础医学院药理学系，天津 300070；2.宁夏医科大学总医院，宁夏 银川 750004)

目的 研究无创性延迟肢体缺血预适应(NDLIP)对心脏猝死的预防作用。方法 取健康，体质量(250±10) g的SD ♂大鼠30只，随机分为3组，① 心肌梗死(MI)组：手术结扎动物冠状动脉左前降支(left anterior descending artery，LAD)，2周后成模；② MI+NDLIP组：动物心肌梗死模型成功后，每隔1 d进行1次远端肢体缺血预适应，直至第4周；③ 假手术(Sham)组：作为阴性对照组，心脏LAD只穿线不结扎，不实施NDLIP。各组动物常规饲养，于4周末静脉输注间羟胺(0.2 mg·min-1)进行猝死，记录致猝死过程中的ECG、猝死药物累积量、猝死时间，于猝死末期腹主动脉取血，ELISA法测定血清caspase-3、HSP70、SOD含量。结果 间羟胺致动物心脏猝死时，随着给药量的增加，动物的心率呈下降趋势，记录给药0、5、10、30、50、70、90 min时动物的心率。与MI组相比， MI+NDLIP组给药0、5、10、30、50 min时动物心率[(479±8)vs(416±19) beat·min-1，(446±32)vs(370±20) beat·min-1，(376±53)vs(305±29) beat·min-1，(307±63)vs(244±33) beat·min-1，(283±45)vs(121±35) beat·min-1，P<0.01]明显较高。与MI组相比，MI+NDLIP组动物的致猝死药物累积量、猝死时间[(14.58±3.03)vs(10.76±2.73) mg，(72.9±15.2)vs(53.8±13.6) min，P<0.01]都明显增加。与MI组相比，MI+NDLIP组血清caspase-3[(2.01±0.52)vs(2.34±0.38) μg·L-1，P<0.01]表达量明显降低；HSP70[(3.01±0.58)vs(2.70±0.43) μg·L-1，P<0.05]水平明显升高；SOD [(1.99±0.65)vs(1.70±0.58) mg·L-1，P<0.01]水平明显升高。结论 无创性延迟肢体缺血预适应能有效预防大鼠心梗后心脏性猝死，其机制可能与降低心肌细胞凋亡、增加保护性蛋白的表达以及增强心肌抗氧化能力有关。

心脏猝死；心肌梗死；无创性延迟肢体缺血预适应；caspase-3； HSP70；SOD

心脏性猝死(sudden cardiac death，SCD)是指因心脏原因导致的突然死亡。SCD最常见的病因是冠心病，尤其是患有急性心肌梗死的患者。心肌梗死造成的局部心肌缺血诱导折返性心律失常形成，进一步加重病变组织与正常组织的复极离散性，最终导致恶性心律失常而诱发猝死[1-3]。同时，机体内环境失调，如交感神经过度兴奋、迷走神经功能低下等可增加心肌梗死患者心肌电不稳定性，更易诱发严重室颤而致死。

目前在预防SCD方面，高危人群通常采用埋藏式心脏复律除颤器(implantable cardioverter defibrillator，ICD)，但由于费用昂贵，在我国的应用并不广泛；中国的自动体外除颤器(automatic external defibrillator，AED)使用率低；抗心律失常药物胺碘酮、β受体阻滞剂，以及血管紧张素转换酶抑制剂(angiotensin-converting enzyme inhibitor，ACEI)、血管紧张素受体阻断剂(angiotensin receptor blockers，ARBs)与他汀类药物等仍是预防SCD的主要手段，但是单独作为SCD的预防性措施却远远不够[4-9]。因此，探索更加有效的预防SCD的方法仍是今后研究的难点和热点。

远端缺血预适应是一种安全无创、成本低的技术。不少研究证实无创性延迟肢体缺血预适应(noninvasive delayed limb ischemic preconditioning，NDLIP)可减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤，对心肌具有保护作用[10-13]。本室前期实验研究证实NDLIP可减轻心肌梗死后心肌损伤，降低心肌过氧化损伤，减少心律失常[14-16]，对心肌梗死预后有积极作用。因此，我们设想NDLIP是否能对心肌梗死后的心脏性猝死起到一定的预防作用。本实验将探索其对大鼠心肌梗死后SCD的预防作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 鼠龄相同、体质量(250±10) g的SD ♂大鼠30只[SPF级，实验动物质量合格许可证号：SCXK-(军)2012-0004]，由中国人民解放军军事医学科学院卫生学环境医学研究所实验动物中心提供。

1.1.2 药品与试剂 0.9% 氯化钠注射液(sodium chloride injection；生理盐水，normal saline，NS)，天津大冢制药有限公司，中国；肝素钠注射液，天津生物化学制药有限公司，中国；氨基甲酸乙酯(乌拉坦，urethane)，上海展云化工有限公司，中国；戊巴比妥钠，Sigma，美国；重酒石酸间羟胺注射液，天津金耀药业有限公司，中国；二甲苯，国药集团化学试剂有限公司，中国；胱天蛋白酶3(caspase-3)试剂盒、热休克蛋白70(HSP70)试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒均为加拿大Hermes Criterion Biotechonlogy产品。

1.1.3 仪器 BL-420S生物机能实验系统、HX-100E小动物呼吸机，成都泰盟科技有限公司；外科手术器械，张家港市双鹿医疗器械有限公司；L420台式低速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；HZS-H水浴震荡器，哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；WZ-50C6型微量注射泵，上海软隆科技发展有限公司。

1.2 方法

1.2.1 实验分组 ① 心肌梗死组(MI group，n=10)；②心梗+无创性肢体缺血预适应组(MI+NDLIP group，n=10)；③假手术组(Sham group，n=10)。各组动物第4周时进行心脏猝死实验。

1.2.2 模型建立 心肌梗死模型：大鼠用3%戊巴比妥钠(45 mg·kg-1)腹腔注射麻醉。暴露心脏后，迅速在左心耳与肺动脉圆锥交界处平左心耳下缘2 mm进针，以7-0手术缝合线结扎冠状动脉左前降支(left anterior descending artery，LAD)。结扎完成后，立即将心脏放回胸腔，置入塑料软管并与注射器连接，迅速对合、捏紧皮肤，抽出胸腔内气体，立即拔管并进行胸外按压。观察心电图，心搏正常且动物呼吸平稳后，进行缝合。伤口消毒，保持体温在36.5～38℃。肌肉注射20万U青霉素钠预防感染。

无创性肢体缺血预适应模型：大鼠用3%戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉，以改良的动物无创血压测试仪自制套管套住大鼠左后肢根部，脉搏传感器紧贴在足背动脉上，加压使脉搏消失、肢体远端体温下降、皮肤发绀，即为阻断股动脉标志，持续5 min；减压，脉搏出现、体温回升、皮肤潮红，为再灌标志，持续5 min，共3个循环。心肌梗死模型成功后，每隔1 d进行1次远端肢体缺血预适应，直至4周。

心脏猝死模型：各组动物在第4周时进行猝死实验。动物用25%乌拉坦麻醉。分离大鼠左侧颈总动脉，行心室插管，监测大鼠血流动力学参数。分离右侧颈总静脉，做静脉插管，连接恒速输液装置。检查好后打开恒速输液泵，开始给予重酒石酸间羟胺进行猝死，给药速率0.2 mg·min-1，同时开始记录电生理参数。

1.2.3 观测指标及方法

1.2.3.1 NDLIP对动物猝死实验时电生理学的影响 检测并记录动物在进行心脏猝死实验时的血流动力学指标。

1.2.3.2 NDLIP对动物猝死时间的影响

1.2.3.3 NDLIP对动物猝死时药物累积量的影响

1.2.3.4 血清caspase-3、HSP70、SOD的含量测定 各组动物于猝死末期腹主动脉取血约5 mL，室温(25℃)放置1 h，离心取血清(3 000 r·min-1，15 min)，置于-80℃保存作为样品。采用ELISA法测定标本中caspase-3、HSP70、SOD水平。

2 结果

2.1 模型的建立 LAD结扎前心电图正常，结扎后出现R波峰减低，然后出现ST段抬高和ST-T融合，出现明显的病理性Q波。2周后，心电图近乎正常，T波低平；开胸后，可见明显的心肌梗死区，其颜色发白，与周围心肌形成明显的分界，且梗死局部室壁运动减低或消失。表明大鼠心肌梗死模型建立成功。心肌梗死模型建立成功后，我们使用间羟胺致心梗大鼠猝死，大鼠心率逐渐减慢，心脏收缩力减弱，1 h内发生猝死。

2.2 NDLIP对动物猝死实验过程中心脏电生理学的影响 采用间羟胺致动物心脏猝死时，随着给药量的增加，动物心率呈下降趋势。Sham组动物心率下降缓慢，直至90 min时动物仍有心率。MI组动物心率下降最为迅速，分别比Sham组心率低8%、10%、22%、29%、58%，且动物均在60 min内猝死；MI+NDLIP组动物心率下降较MI组缓慢，在每个监测时段的心率都比MI组高(Fig 1)，分别比MI组高15%、20%、23%、26%、133%(P<0.01)。

Fig 1 Changes of heart rate in rats before SCD induced by venous infusion of metaraminol (0.2 mg·min-1) in each

△P<0.05，△△P<0.01vssham group；**P<0.01vsMI group. MI: myocardial infarction；NDLIP: noninvasive delayed limb ischemic preconditioning

2.3 NDLIP对动物猝死实验过程中致猝死药物累积量以及猝死时间的影响 如Fig 2 和Fig 3显示，MI组动物所用致猝死药物量以及猝死时间明显少于Sham组，分别减少了49%(P<0.01)。MI+NDLIP组所用致猝死药物的累积量和猝死时间分别比MI组增加36%和35%(P<0.01)，表明NDLIP干预后，情况明显改善。

2.4 NDLIP对caspase-3、HSP70以及SOD表达的影响 动物血清caspase-3表达量(Fig 4)：Sham组最低，MI组比Sham组高56%(P<0.01)，MI+NDLIP组比MI组减少了14%(P<0.01)。动物血清HSP70表达量(Fig 5)：Sham组最低，MI组比Sham组高，但差异无显著性，MI+NDLIP组比MI组增加了11%(P<0.05)。动物血清SOD表达量(Fig 6)： Sham组最高，MI组比Sham组低33%(P<0.01)，MI+NDLIP组比MI组增加了17%(P<0.01)。

Fig 2 Drug cumulant amount in rats before SCD induced by venous infusion of metaraminol (0.2 mg·min-1) in each

△△P<0.01vssham group；**P<0.01vsMI group

Fig 3 Sudden death onset time in rats before SCD induced by venous infusion of metaraminol (0.2 mg·min-1) in each

△△P<0.01vssham group；**P<0.01vsMI group

Fig 4 Level of serum caspase-3 concentration in rats before SCD induced by venous infusion of metaraminol (0.2 mg·min-1)

△△P<0.01vssham group；**P<0.01vsMI group

Fig 5 Level of serum HSP70 concentration in rats before SCD induced by venous infusion of metaraminol (0.2 mg·min-1)

*P<0.05vsMI group

Fig 6 Level of serum SOD concentration in rats before SCD induced by venous infusion of metaraminol (0.2 mg·min-1) in

△△P<0.01vssham group；**P<0.01vsMI group

3 讨论

本实验首先建立大鼠心肌梗死模型，随后用药物制备大鼠心肌梗死后心脏猝死模型。心脏猝死的诱因有多种，其中交感神经过度兴奋为常见原因。在模拟临床病人心梗后交感神经过度兴奋所致猝死的基础上，本实验首次探索并建立以拟肾上腺素药诱发心肌梗死大鼠发生猝死模型。

首先，我们需要选择合适的工具药，对工具药我们有以下要求：① 药物的作用靶点主要在心血管系统；② 药物致猝死的时间要合适，根据心脏猝死的定义，我们需要的理想猝死时间是1 h左右；③ 药物易得，且毒性小。基于以上要求，我们选择了以下药物：肾上腺素、异丙肾上腺素、去氧肾上腺素、麻黄碱、间羟胺。我们发现，上述除间羟胺外的药物诱发猝死率低，且诱发猝死所需用药量大。而间羟胺所致心肌梗死大鼠心脏猝死的药物累积剂量为10.0 mg,且在1 h内猝死，所以我们使用间羟胺制备心脏猝死模型。

在猝死实验中，我们使用NDLIP进行干预后，发现需要使用更多的间羟胺才能使心梗大鼠发生猝死，且猝死时间延长，分析其原因：一方面，可能通过抑制凋亡蛋白表达量、增加保护性蛋白表达量、增强心肌抗氧化能力来保护心肌细胞；另一方面，我们推测可能与降低交感神经兴奋度有关。

心肌梗死过程中，大量心肌细胞凋亡。研究证实，心肌细胞的凋亡是由一系列caspase级联反应引起的，尤其是caspase-3。caspase-3造成细胞凋亡的机制是激活核酸内切酶，造成DNA裂解，破坏细胞内的钙泵功能，导致细胞内钙超载等[17-19]。在有害应激状态下，HSP70表达量增加。许多动物学实验表明HSP70对心肌有保护作用，可通过抗氧化作用、抗细胞凋亡作用、抗自由基等作用保护心肌细胞，并通过抑制NADPH氧化酶减少氧自由基的产生。HSP70表达增加可抑制caspase依赖性的心肌细胞凋亡，减少心肌梗死面积，明显改善心功能[20-22]，同时，增加SOD，加快清除自由基。机体病理状态下会产生大量的自由基，大量的氧自由基又可转变为活性更强的羟自由基，使细胞膜脂质过氧化，引起膜结构和膜功能的损害。体内SOD的水平变化可反映机体的抗氧化功能[23-25]。SOD的水平越高，表明体内的抗氧化酶的水平越高，心肌损伤较轻。我们使用NDLIP进行干预后，MI大鼠的caspase-3表达量明显降低，HSP70表达量明显增加，SOD表达量明显增加。这表明NDLIP发挥预防猝死的作用可能与降低心肌细胞凋亡程度，增加保护性蛋白的表达量，增强心肌抗氧化能力相关。

心脏同时受到交感神经和副交感神经的双重支配，这两者之间的平衡对于维持正常的心功能至关重要。有研究表明，远端缺血预适应可刺激心肌神经平衡再生[26]。因此，我们推测NDLIP发挥预防猝死的作用可能也与抑制交感神经过度兴奋，维持心脏自主神经功能平衡有关。

总之，我们通过探索和实验最终提出用间羟胺来制备大鼠心肌梗死后猝死模型，这为心脏猝死的研究提供了新的途径。同时，在此基础上，我们证实NDLIP对心肌梗死后的心脏猝死具有一定的预防作用，其作用机制可能与降低心肌细胞凋亡、增加保护性蛋白表达量以及增强心脏抗氧化能力等相关。今后，通过对NDLIP对心肌损伤保护作用的机制以及对心脏自主神经的影响进行更为深入的探究，将能为临床预防心肌梗死患者发生心源性猝死提供新的思路。

(致谢：本文实验是在天津医科大学基础医学院药理学系药理学实验室完成，感谢实验室成员的参与和帮助！)

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Preventative effects of noninvasive delayed limb ischemic preconditioning on sudden cardiac death in rats after myocardial infarction

LI Yan1, CHEN Wen-hua1,2, SUN Kai1, ZHANG Ying1, AN Meng-yao1,PAN Ying-ying1, WU Yan-na1, KANG Yi1, GAO Wei-zhen1, LOU Jian-shi1

(1.DeptofPharmacology,BasicMedicalCollege,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300070,China；2.GeneralHospitalofNingxiaMedicalUniversity,Yinchuan750004,China)

Aim To study the preventative effects of noninvasive delayed limb ischemic preconditioning (NDLIP) on sudden cardiac death in rats with myocardial infarction. Methods Thirty healthy SD male rats weighting (250±10) g were randomly divided into 3 groups: ① myocardial infarction (MI) group: animal model of MI was established by making surgical ligation of animal LAD. ② MI plus NDLIP group: after the success of the animal model of MI, NDLIP was carried out every other day until 4th week. ③ Sham group: as the negative control group, animals were taken heart LAD threading but no ligation. All rats were fed conventionally. At the end of 4 weeks, three groups of rats were administered with metaraminol(0.2 mg·min-1). ECG, drug cumulant of sudden death and death onset time were recorded. After sudden death, blood samples were withdrawn from abdominal aorta and serum was separated via centrifugation. ELISA method was used to measure serum caspase-3, HSP70 and SOD concentration. Results While metaraminol led animal cardiac sudden death, the rats heart rate (HR) kept declining with the increase of dosage of metaraminol during the administration period. Rat HR of MI+NDLIP group [(479±8)vs(416±19) beat·min-1, (446±32)vs(370±20) beat·min-1, (376±53)vs(305±29) beat·min-1, (307±63)vs(244±33) beat·min-1, (283±45)vs(121±35) beat·min-1,P<0.01] was markedly higher than that of MI group at 0, 5, 10, 30, 50 min before death. Compared with MI group, drugs cumulant to sudden death and death onset time of MI+NDLIP group [(14.58±3.03)vs(10.76±2.73) mg, (72.9±15.2)vs(53.8±13.6) min,P<0.01] were significantly increased. Compared with MI group, serum caspase-3 content of MI+NDLIP group was significantly reduced [(2.01±0.52)vs(2.34±0.38) μg·L-1,P<0.01]; HSP70 levels were remarkably increased [(3.01±0.58)vs(2.70±0.43) μg·L-1,P<0.05]; SOD levels were significantly improved [(1.99±0.65)vs(1.70±0.58) mg·L-1,P<0.01]. Conclusion NDLIP can prevent sudden cardiac death after myocardial infarction in rats, which may be mediated by reducing the myocardial cell apoptosis, increasing protective protein expression and enhancing antioxidant capacity.

sudden cardiac death; myocardial infarction; noninvasive delayed limb ischemic preconditioning; caspase-3; HSP70; SOD

2016-06-20，

2016-07-18

国家自然科学基金资助项目(No 81072631)；天津自然科学基金资助项目(No 09JCZDJC21100)

李 燕(1992-)，女，硕士生，研究方向：心血管药理学， E-mail：m_159221f@163.com；

陈文华(1991-)，女，硕士，初级药师，并列第一作者，E-mail：feixue120003@163.com；

时间：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.034.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.017

A

1001-1978(2016)11-1565-06

R-332；R323.7；R364.12；R541.022；R542.22

娄建石(1954-)，男，硕士，教授，博士生导师，研究方向：心血管药理学，通讯作者，Tel：022-83336860，E-mail：jianshilou@126.com