1-磷酸鞘氨醇促进胰岛素分泌及可能机制研究

赵艳丽, 丁亚琴, 王 慧, 章 毅, 杨 静, 刘云峰

(山西医科大学 1. 第一临床医学院、2.药理学教研室、3.第一医院内分泌科，山西 太原 030001)



1-磷酸鞘氨醇促进胰岛素分泌及可能机制研究

赵艳丽1,3, 丁亚琴2, 王 慧2, 章 毅2, 杨 静1,3, 刘云峰1,3

(山西医科大学 1. 第一临床医学院、2.药理学教研室、3.第一医院内分泌科，山西 太原 030001)

目的 研究1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate, S1P)促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌效应及其分子机制，探索糖尿病治疗药物的作用靶点。方法 使用胶原酶P消化SD大鼠胰腺，Histopaque 1077梯度离心获得胰岛，Dispase II消化得到胰岛细胞。不同浓度S1P(0～20 μmol·L-1)干预，观察低糖(2.8 mmol·L-1)和高糖(16.7 mmol·L-1)条件下胰岛素分泌的变化。膜片钳技术记录β细胞电压依赖性钾通道电流(Kv电流)，观察S1P干预后Kv电流的变化。钙成像技术记录β细胞内Ca2+浓度，观察不同浓度S1P(0～20 μmol·L-1)干预后细胞内的Ca2+浓度变化。结果 与低糖组相比，高糖组明显刺激了胰岛素的分泌(P<0.01)。低糖条件下，S1P没有改变胰岛素分泌量(P>0.05)。高糖条件下，S1P浓度依赖性增加了胰岛素分泌量(P<0.01)。与对照组相比，S1P明显抑制了β细胞Kv电流(P<0.01)。高糖条件下，S1P浓度依赖性升高了胰岛细胞内Ca2+浓度(P<0.01)。结论 S1P可能通过抑制β细胞Kv电流、升高细胞内Ca2+浓度，最终促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌。

1-磷酸鞘氨醇；Ca2+；胰岛素分泌；电压依赖性钾通道；SD大鼠；β细胞

国际糖尿病联盟调查显示，截至2013年，全球约有4亿糖尿病患者，预计2040年将达到6.42亿，而糖尿病每年的死亡人数已经高达500万[1]。可见糖尿病已经严重威胁到全球公民的健康。糖尿病常常伴有血糖的升高，而胰岛素的分泌增加是对血糖升高的直接反应，同时，血液中其他营养物质也可以增加葡萄糖刺激的胰岛素分泌，例如氨基酸、脂肪酸等[2]。当血液中葡萄糖浓度升高时，三羧酸循环活动加强，ATP生成增多，ATP/ADP比值升高，ATP敏感性钾通道(KATP)关闭，进而细胞膜去极化，电压依赖性钙通道开放，钙内流导致细胞Ca2+浓度增加，促进胰岛素囊泡的胞吐作用[3-4]。研究证实[5]，1-磷酸鞘氨醇(sphingosine-1-phosphate，S1P)可以刺激葡萄糖依赖性的胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion，GSIS)，但其作用机制目前并不清楚。本研究通过分离SD大鼠胰岛和细胞，验证S1P是否通过抑制Kv电流和升高细胞内Ca2+浓度，从而促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 8～10周龄的♂ SD大鼠，体质量250 g～280 g，由山西医科大学实验动物中心提供。生产许可证号：SCXK(晋)2015-0001。

1.1.2 试剂 S1P(美国Cayman,批号：0467600-11)；胶原酶P(瑞士Roche，批号：11104222)； D-葡萄糖(北京索莱宝，批号：405A0918)；BSA(北京索莱宝，批号：831O0513)；HEPES(北京索莱宝，批号：710B048)；青链霉素(北京索莱宝，批号：20150909)；Histopaque 1077(美国Sigma，批号：RNBF1783)；胎牛血清(上海生工，批号：B326FA0092)；RPMI 1640培养基(上海生工，批号：C518FA0002)；Dispase II(美国Amresco，批号：10888700)；胰岛素检测试剂盒(北京北方生物技术研究所，批号：20160320)。

1.1.3 仪器 电子天平(上海精密，型号：GB/T26497)；体式显微镜(上海中恒，型号：SM262)；倒置显微镜(日本OLYMPUS，型号：AE-2000)；台式离心机(长沙湘仪，型号：SC-3610)；细胞培养箱(北京博奥恒信生物科技，型号：HF100)；MODEL电极拉制仪(日本Narishige，型号：PP-830)；MIRO FORGE抛光仪(日本Narishige，型号：MF-200)；EPC10全自动膜片钳(德国HEKA，型号：MP-285)；钙成像(北京MDE，型号：LAMBDA 10-B)。

1.2 方法

1.2.1 胰岛及细胞的分离和培养 ① 使用断头法处死大鼠，1 g·L-1胶原酶P溶液(不含血清的RPMI 1640培养基溶解)消化胰腺，37℃水浴消化、Histopaque 1077梯度离心后，在体显微镜下手工挑取胰岛，将挑好的胰岛加入培养液后，放入37℃恒温孵箱中培养[3]。② 5 g·L-1Dispase II溶液(PBS溶解)消化状态良好的胰岛为单个细胞，离心后，均匀滴在预先滴过细胞黏附剂的玻片上，加入培养液后，放至37℃恒温孵箱中培养[3]。

1.2.2 胰岛素分泌实验 KRBH缓冲液成分(mmol·L-1)：644.0 NaCl、24.0 KCl、6.0 KH2PO4、6.0 MgSO4、12.5 CaCl2·2H2O、50 HEPES，此外，每100 mL KRBH缓冲液中再加入0.042 g NaHCO3、2 g BSA。酸乙醇成分(mL·100mL-1)：75无水乙醇、23.5蒸馏水、1.5浓盐酸。实验共4组，每组7个管，每管挑入大小均一，状态良好的5个胰岛。① 每组在低糖(2.8 mmol·L-1，LG)KRBH孵育液中孵育1 h，弃上清。② 分别在含S1P 0、5、10、20 μmol·L-1的低糖KRBH孵育液中孵育30 min，收集上清液待测。③ 分别在含S1P 0、5、10、20 μmol·L-1的高糖(16.7 mmol·L-1，HG)KRBH孵育液中孵育30 min，收集上清液待测。④ 每管加入500 μL的酸乙醇，超声粉碎仪粉碎胰岛组织，稀释80 000倍后留取待测。待测样本均使用放射免疫方法测胰岛素含量。

1.2.3 膜片钳技术记录Kv电流 细胞外液成分(mmol·L-1)：141.9 NaCl、5.6 KCl、1.2 MgCl2、5.0 HEPES、11.1葡萄糖，pH=7.40。细胞内液成分(mmol·L-1)：140.0 KCl、1.0 MgCl2、0.05 EGTA、10.0 NaCl和10.0 HEPES ，pH=7.30。① 细胞膜电容>7pF的为β细胞，在-70 mV的钳制电压下给予-70～80 mV电压刺激400 ms，每次递增10 mV,检测Kv电流。② 细胞外液中加入S1P(10 μmol·L-1)，方法同上，观察Kv电流变化情况。

1.2.4 钙成像技术检测细胞内Ca2+浓度 使用含有2 μmol·L-1Fura-2AM的低糖(2.8 mmol·L-1)染液孵育胰岛细胞后，置于高糖(16.7 mmol·L-1)溶液中，在510 nm发射波长、380 nm和340 nm激发波长下，可得到F340/F380的比值。在高糖条件下，观察不同浓度S1P(0、5、10、20 μmol·L-1)干预前后的F340/F380的变化。

2 结果

2.1 分离的SD大鼠胰岛及细胞 如Fig 1所示，分离的大鼠胰岛质地均一，状态良好，边缘圆润，胰岛细胞状态良好，包膜完整。

Fig 1 Rat pancreatic islets and cells

A：Isolated rat pancreatic islets digested by collagenase P(×10)； B： Isolated rat pancreatic islet cells digested by Dispase II(×40)

2.2 S1P干预对GSIS的影响 每组7个管(每管5个胰岛)，在低糖和高糖下，不同浓度S1P(0、5、10、20 μmol·L-1)干预，观察胰岛素分泌的变化，所测胰岛素以2.8 mmol·L-1葡萄糖为标准，标化后结果见Tab 1。与低糖比较，高糖明显刺激了胰岛素分泌(P<0.01)。低糖条件下，S1P干预后，胰岛素含量没有明显变化(P>0.05)。高糖条件下，S1P浓度依赖性刺激了胰岛素的分泌(P<0.01)。

2.3 S1P干预的Kv电流变化 在-70 mV的钳制电压下给予-70～80 mV电压刺激400 ms，每次递增10 mV,检测Kv电流。与对照组相比，S1P(10 μmol·L-1)明显抑制了Kv电流[对照组(110.714 6±4.811 3) pA/pF，n=8；S1P组(68.094 3±2.927 1) pA/pF，n=8；P<0.01](Fig 2)。

2.4 S1P干预的细胞内Ca2+变化 使用含2 μmol·L-1Fura-2 AM低糖染液孵育细胞后，置于高糖溶液中，在510 nm发射波长、380 nm和340 nm激发光下，测得F340/F380。不同浓度S1P(0、5、10、20 μmol·L-1)干预，可以看到S1P浓度依赖性增加了细胞内Ca2+浓度，以S1P(0 μmol·L-1)为标准标化，结果如下： 0 μmol·L-1，1.000 0±0.039 3，n=5；5 μmol·L-1, 1.152 8±0.049 3，n=5；10 μmol·L-1, 1.382 8±0.063 4，n=5；20 μmol·L-1, 1.718 8±0.031 2，n=5。见Fig 3。

Tab 1 S1P promotes glucose-stimulated insulin ±s，n=7)

LG: low glucose(2.8 mmol·L-1) , HG: high glucose (16.7 mmol·L-1).##P<0.01vsLG group(S1P 0 μmol·L-1);*P<0.05,**P<0.01vsHG group(S1P 0 μmol·L-1)

Fig 2 S1P inhibits Kv currents of pancreatic beta cells

A,B：Representive current traces recorded under control and S1P treatment conditions from rat beta cells； C： Current-voltage curves of Kv channels under control and S1P treatments conditions； D： Summary of the mean current density of Kv channels recorded at 80 mV depolarization.**P<0.01vscontrol group.

Fig 3 S1P increases the level of intracellular

A： The changes of fluorescence intensity after S1P treatments from beta cells； B： Traces show the changes of intracellular Ca2+level after S1P treatments under high glucose condition； C： The ratio of fluorescence intensity (F340/F380) after S1P treatments, five cells were tested.**P<0.01vscontrol.

3 讨论

糖尿病的发病率逐年上升，已成为继心脑血管疾病、肿瘤之后第3位严重危害人民健康的重要慢性非传染性疾病[6]。1型糖尿病发病机制主要是胰岛素绝对缺乏，2型糖尿病则主要是胰岛素抵抗伴有胰岛素分泌不足，但两者共同的核心病理环节都是β细胞功能的衰退[7]。鞘脂类代谢产物S1P是一种有活性的脂质分子，在细胞内外均发挥重要作用，已经证实，在肿瘤、心血管疾病、骨代谢及糖尿病方面均有明显作用[8-10]。本实验中，与低糖相比，高糖明显刺激了胰岛素分泌。S1P干预后，低糖条件下并没有影响胰岛素分泌，而在高糖条件下，浓度依赖性促进了胰岛素分泌。在Hasan等[11]研究中发现，S1P可以促进β细胞的生存和生长，抑制其凋亡，促进GSIS。在研究中发现，高糖可以激活鞘氨醇激酶2(SphK2)，增加S1P的生成，促进GSIS[5]。本实验中，在高糖条件下，S1P明显抑制了β细胞的Kv电流，减少钾外流。研究已经证明Kv通道参与动作电位的形成，抑制Kv电流可以延长动作电位时程、升高细胞内钙浓度，从而促进胰岛素分泌[3]。细胞内的S1P可以调节钙动员，升高细胞内的Ca2+水平，促进β细胞生长，抑制其凋亡[11-12]。本实验证实高糖条件下，S1P干预后，浓度依赖性增加了细胞内的Ca2+水平，而Ca2+作为细胞内的第二信使，可以调节众多过程，其中包括增加胰岛素分泌。我们推测，S1P可能通过抑制Kv电流，延迟了动作电位时程，进而增加钙离子内流，导致细胞内钙增加，从而促进了胰岛素分泌。

综上，本实验通过分离和培养SD大鼠原代胰岛、细胞，证实了S1P可能通过抑制细胞Kv电流、升高胰岛细胞内Ca2+浓度，最终促进了葡萄糖刺激的胰岛素分泌。此结果对于胰岛素促泌剂的研发提供了实验依据，为糖尿病的治疗提供了新的治疗方向。但关于S1P促进葡萄糖刺激的胰岛素分泌的下游信号通路仍待进一步研究。

(致谢：本文实验在山西医科大学药理教研室章毅老师实验室完成，在此对参与实验的人员表示感谢。)

[1] Felton A M, Lasalle J, Mcgill M. Treatment urgency: the importance of getting people with type 2 diabetes to target promptly[J].DiabetesResClinPract,2016,16(4):1-26.

[2] Fu Z, Gilbert E R, Liu D. Regulation of insulin synthesis and secretion and pancreatic beta-cell dysfunction in diabetes[J].CurrDiabetesRev,2013, 9(1): 25-53.

[3] Zhang Y, Guo Q, Li X. P2Y purinergic receptor-regulated insulin secretion is mediated by a cAMP/Epac/Kv channel pathway[J].BiochemBiophysResCommun, 2015, 460(3): 850-6.

[4] Rocheleau J V, Walker G M, Head W S. Microfluidic glucose stimulation reveals limited coordination of intracellular Ca2+activity oscillations in pancreatic islets[J].ProcNatlAcadSci, 2004, 101(35): 12899-903.

[5] Cantrell S J, Morris A J, Sunkara M. Sphingosine 1-phosphate (S1P) regulates glucose-stimulated insulin secretion in pancreatic beta cells[J].JBiolChem, 2012, 287(16): 13457-64.

[6] 中华医学会糖尿病学分会. 中国2型糖尿病防治指南(2013年版)[J]. 中国糖尿病杂志，2014,22(8): 2-42.

[6] Diabetes Association of the Chinese Medical Association. Guidelines for the prevention and treatment of type 2 diabetes mellitus in China (2013 Edition)[J].ChinJDiabetes, 2014, 22(8):2-42.

[7] Imasawa T, Koike K, Ishii I. Blockade of sphingosine 1-phosphate receptor 2 signaling attenuates streptozotocin-induced apoptosis of pancreatic beta-cells[J].BiochemBiophysResCommun, 2010, 392(2): 207-11.

[8] Maceyka M, Harikumar K B, Milstien S. Sphingosine-1-phosphate signaling and its role in disease[J].TrendsCellBiol, 2012, 22(1): 50-60.

[9] Brinkmann V. Sphingosine 1-phosphate receptors in health and disease: mechanistic insights from gene deletion studies and reverse pharmacology[J].PharmacolTher, 2007, 115(1): 84-105.

[10] 贺 苗,赵 杰,苏 健. 1-磷酸鞘氨醇后适应对大鼠心肌缺血/再灌注损伤的保护作用[J]. 中国药理学通报, 2013, 29(10):1369-73.

[10] He M, Zhao J, Su J. Protective effect of sphingosine 1-phosphate postconditioning on myocardial ischemia /reperfusion injury in rats[J].ChinPharmacolBull,2013,29( 10):1369-73．

[11] Hasan N M, Longacre M J, Stoker S W. Sphingosine kinase 1 knockdown reduces insulin synthesis and secretion in a rat insulinoma cell line[J].ArchBiochemBiophys, 2012, 518(1): 23-30.

[12] Laychock S G, Sessanna S M, Lin M H. Sphingosine 1-phosphate affects cytokine-induced apoptosis in rat pancreatic islet beta-cells[J].Endocrinology, 2006, 147(10): 4705-12.

Effects and possible mechanism of sphingosine-1-phosphate-stimulated insulin secretion from rat islets

ZHAO Yan-li1,3, DING Ya-qin2, WANG Hui2, ZHANG Yi2, YANG Jing1,3, LIU Yun-feng1,3

(1.theFirstClinicalMedicalCollege, 2.DeptofPharmacology, 3.DeptofEndocrinologyoftheFirstHospital,ShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China)

Aim To observe the effects of glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) on rat islets after S1P treatments and the underlying molecular mechanisms. Methods Collagenase P and Histopaque 1077 were used to digest and isolate rat pancreatic islets, and Dispase II was used to digest pancreatic islet to obtain pancreatic cells. Insulin secretions were measured after S1P (0～20 μmol·L-1) treatment under low glucose (LG, 2.8 mmol·L-1) and high glucose (HG, 16.7 mmol·L-1) conditions. Patch-clamp recordings were applied to monitor voltage-dependent potassium channel currents (Kv currents) after S1P treatment. Calcium image technique was used to measure the changes of intracellular Ca2+concentration after S1P (0～20 μmol·L-1) treatments. Results HG group significantly increased insulin secretion compared to LG group (P<0.01) . S1P had no effect on insulin secretion under LG condition (P>0.05). S1P increased insulin secretion significantly in a dose-dependent manner under HG condition (P<0.01) . Kv currents of β cells were inhibited significantly after S1P treatment (P<0.01) . S1P increased the concentrations of intracellular Ca2+in a dose-dependent manner under HG condition(P<0.01) . Conclusion S1P may promote GSIS by inhibiting Kv currents and increasing the level of intracellular Ca2+.

sphingosine-1-phosphate; Ca2+; insulin secretion; voltage-dependent potassium channels; SD rat; β cell

2016-06-17，

2016-07-27

国家自然科学基金资助项目(No 81273564，81373464)；山西省自然科学基金资助项目(No 201401143)；山西省回国留学人员科研资助项目(No 2013-111);中华医学会临床医学科研专项资金项目(No 13040440429)；山西医科大学第一医院青年创新基金资助项目(No YC1422)；山西省留学回国人员科技活动项目择优资助项目(No 2016-97)

赵艳丽(1990-)，女，硕士生，医师，研究方向：糖尿病的治疗及发病机制，E-mail：zhaoyanli995@163.com；

刘云峰(1973-)，女，博士，副主任医师，硕士生导师，研究方向：糖尿病的治疗及发病机制，通讯作者，E-mail：nectarliu@163.com

时间：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.016.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.008

A

1001-1978(2016)11-1516-05

R-332；R329.24；R335.6；R587.105；R977.15