头顶一颗珠醇提物对新生大鼠缺血/缺氧性脑损伤的保护作用

邱 勇，李人鹏，刘 粟，谭志鑫，陈龙全，刘 红，吴 昊

(湖北民族学院 1. 医学院、2. 科技学院、3.附属民大医院, 湖北 恩施 445000)



头顶一颗珠醇提物对新生大鼠缺血/缺氧性脑损伤的保护作用

邱 勇1，李人鹏2，刘 粟3，谭志鑫1，陈龙全1，刘 红1，吴 昊2

(湖北民族学院 1. 医学院、2. 科技学院、3.附属民大医院, 湖北 恩施 445000)

头顶一颗珠；新生大鼠；缺血/缺氧；脑损伤；神经元细胞；凋亡

新生儿缺血/缺氧性脑损伤(hypoxia-ischemic brain damage, HIBD)是新生儿在围产期发生窒息缺氧，导致部分或整个脑组织的缺血/缺氧性损伤，从而引起一系列神经系统病变[1-3]。这些严重的并发症包括学习障碍、癫痫，甚至脑瘫和精神发育迟滞等[4-5]。然而，不管如何改善产科和新生儿护理，HIBD伴随的严重的神经功能障碍仍然是一个严峻的临床问题[6]。目前，临床上对于HIBD患儿改善其神经发育障碍的治疗尚无明显效果。越来越多的证据表明，氧化应激和细胞凋亡是HIBD致病的主要因素[7]。因此，根据发病机制去寻求改善脑损害的药物是国内外围产及新生儿医学领域的重要课题。

头顶一颗珠为百合科延龄草属植物头顶一颗珠(TrilliumtschonoskiiMaxim.，TTM)的干燥根及根状茎，是土家四大神药之一，具有镇静安神、活血止血、解毒等功效[8]。其疗效确切，但由于属于民族药，主要应用于土家族、苗族聚集地，尚未得到广泛应用。目前，有研究表明其具有改善脑缺血，改善学习记忆等作用[9-10]。为进一步了解其功能，促进该药的应用，本文就头顶一颗珠对新生大鼠缺血/缺氧性脑损伤进行研究，探讨其对HIBD后神经细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 头顶一颗珠由我院中草药标本中心提供，经专家王从荣教授鉴定为头顶一颗珠。称量头顶一颗珠100 g，取粗粉，乙醇回流提取3次，去渣除醇，并浓缩至1 kg·L-1备用。氯化三苯基四氮唑(TTC)：美国 Sigma 公司；甲苯胺蓝：上海谱振生物科技有限公司；Bax、Bcl-2抗体：Cell Signaling Technology。

1.2 仪器 CY-12C型便携式数字测氧仪(杭州梅城电化分析仪器厂)，T18匀浆机(德国IKA集团)，天能EPS300电泳仪(上海天能科技有限公司)，Tanon 4200全自动化学发光成像分析系统(上海天能科技有限公司)。

1.3 实验动物及分组 健康7日龄SD大鼠，♀♂不限，体质量12 g左右，由湖北省实验动物研究中心提供，许可证号SCXK(鄂)2015-0018。随机分为假手术组(n=10)、HIBD组(n=20)、头顶一颗珠组(n=20)。

1.4 HIBD模型建立及给药 采用Rice 法制作 HIBD模型[11-12]，即将7日龄SD大鼠右侧颈总动脉分离并结扎后，置入37 ℃ 的密闭盒子，通入体积分数为0.08的O2和体积分数为0.92的 N2的混合气体，持续缺氧2 h，缺氧后，放回母鼠笼中喂养。假手术组只用切开皮肤，找到右侧颈总动脉后分离，不结扎，再将皮肤缝合，不予以缺氧处理。HIBD模型制备完成后，头顶一颗珠组立即腹腔注射头顶一颗珠醇提物(0.1 g · kg-1)，每日1次，连续给药3 d。假手术组和模型组给予相同剂量的生理盐水。

1.5 TTC染色 治疗3 d后，予以乙醚吸入麻醉后断头取脑，将脑组织放入-20 ℃冰箱速冻20 min后切片，然后将脑片置于2% 的TTC中，用锡箔纸遮光后，放入37 ℃恒温箱中孵育15～30 min，并不时翻动脑片，使脑片染色均匀。

1.6 尼氏染色 各组动物麻醉后灌注并断头取脑，将脑组织放入4%的多聚甲醛溶液中，24 h 后予以石蜡包埋、切片、脱蜡，再将切片置入1% 的甲苯胺蓝水溶液中染20 min后，水洗、酒精分化并脱水、封片。在光镜下观察神经细胞改变。

1.7 Western blot 取0.1 g脑组织，加RIPA细胞裂解液和PMSF后匀浆，4 ℃、12 000 r· min-1离心20 min，取上清，BCA定量后，加loading buffer水煮10 min，取适量样品经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，将蛋白转移到PVDF膜上，用脱脂奶粉室温封闭3 h，用相应的一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗3次，每次15 min，室温孵育相应的二抗2 h后，继续用TBST洗膜3次，再以ECL显色。随后用Quantity One软件测定分析结果。

2 结果

2.1 头顶一颗珠对HIBD的影响 观察新鲜脑组织发现，假手术组脑组织整体形态完好；模型组可见明显肿大，且右侧脑部可见缺血的白色坏死区；治疗组可见大脑形态完好，未见明显肿胀及坏死。通过TTC染色，了解脑缺血/缺氧的情况。在假手术组中，TTC染色未见缺血现象；模型组可见右侧脑部出现明显缺血区，提示造模成功；头顶一颗珠治疗组脑缺血区面积较模型组明显减少，见Fig 1。

2.2 头顶一颗珠对海马神经元的影响 由Fig 2可见，假手术组海马神经元分布整齐、排列密集，且神经元胞体大，细胞核大而圆，内含有丰富的尼氏小体。模型组海马神经元分布紊乱，数量较假手术组明显减少，且神经元胞体形态缺失或不全，部分尼氏小体可见溶解现象。头顶一颗珠治疗组海马神经元排列有序，数量稍有减少，但比模型组密集，胞体大小正常，内含丰富尼氏小体。

2.3 头顶一颗珠对皮层神经元的影响 假手术组可见皮层区的神经元细胞排列密集，神经元胞体饱满，细胞核大而圆，内含有丰富的尼氏小体。经HIBD造模后，可见皮层神经元排列较假手术组明显稀疏，且神经元胞体萎缩，形态缺失，大部分尼氏小体溶解。头顶一颗珠治疗组可见皮层神经元排列较模型组稍密集，且细胞形态尚可，胞体较饱满，尼氏小体溶解现象较模型组好转。见Fig 3。

Fig 1 Effect of TTM against HIBD

A: Sham group; B: Model group; C: TTM group

2.4 头顶一颗珠对凋亡蛋白的影响 与假手术组相比，HIBD模型组Bcl-2明显降低(P<0.01)，Bax明显升高(P<0.01)；经头顶一颗珠治疗后，可见Bcl-2明显升高(P<0.01)，Bax明显降低(P<0.01)。见Fig 4。

3 讨论

HIBD是临床上常见的儿科疾病，其病因机制复杂多样。有研究表明，凋亡在整个缺血/缺氧损伤中起着重要的作用[13]，其中可能涉及能量衰竭、自由基损伤、细胞内钙离子超载、兴奋性毒性及caspase依赖介导等最终导致细胞凋亡[14-16]。目前认为，Bcl-2家族是与 HIBD中细胞凋亡关系最密切的影响因素之一[17]， 其中，Bcl-2及Bax均属于Bcl-2家族，是存在于线粒体膜上的一对相互拮抗的蛋白。在缺氧/缺血过程中，激活了多种通路的凋亡刺激信号，Bcl-2 及Bax所保持的抑制和促进凋亡的平衡被打破，而线粒体外膜通透性增加，导致促凋亡因子释放，从而出现细胞凋亡[18]。因此，对神经元细胞凋亡的发生机制及抗凋亡治疗的研究可能为HIBD的治疗开辟新的途径，从而减少 HIBD后遗症的发生。

目前有研究表明，部分天然药物的有效成分具有抗神经细胞凋亡的作用[19]。因此，我们尝试应用中草药头顶一颗珠治疗HIBD。通过动物模型的构建，发现HIBD后大脑可见水肿，并出现明显缺血区域，伴有神经元细胞的大量坏死。通过腹腔注射头顶一颗珠治疗后，发现头顶一颗珠可明显改善脑缺血情况，并可缓解大脑缺血/缺氧后水肿情况，也可减少神经元细胞的死亡，同时，头顶一颗珠可明显上调Bcl-2的表达(P<0.01)，减低Bax的表达(P<0.01)。实验结果表明，头顶一颗珠对HIBD具有保护作用，而其机制可能与降低神经元细胞凋亡有关。

Fig 2 Effect of TTM against HIBD induced hippocampus activities

A:Sham group (×100); B: Model group (×100); C: TTM group (×100); D: Sham group (×400); E: Model group (×400); F: TTM group (×400)

Fig 3 Effect of TTM against HIBD induced cortex activities

A: Sham group (×100); B: Model group (×100); C: TTM group (×100); D: Sham group (×400); E: Model group (×400); F: TTM group (×400)

Fig 4 Effect of TTM against HIBD induced related apoptosis protein

##P<0.01vssham group;**P<0.01vsmodel group

本实验表明，头顶一颗珠可改善HIBD引起的脑缺血损伤，并可通过减少神经元细胞凋亡来保护脑组织。该研究为治疗HIBD的药物提供了新的方向，并有利于头顶一颗珠的应用。

(致谢：本文实验在武汉大学基础医学院神经及免疫相关疾病实验室完成，在此，对实验室的各位老师及同学表示衷心的感谢！)

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The protective effects of ethanol extract ofTrilliumtschonoskiiMaxim.on hypoxia- ischemia brain damage in neonatal rats

QIU Yong1, LI Ren-peng2, LIU Su3, TAN Zhi-xin1, CHEN Long-quan1, LIU Hong1, WU Hao2

(1.CollegeofMedicine, 2.ScienceandTechnologyCollege, 3.AffiliatedHospital，HubeiUniversityforNationalities,EnshiHubei445000,China)

Aim To investigate the effect ofTrilliumtschonoskiiMaxim(TTM) ethanol extract on hypoxia ischemia brain damage (HIBD) in neonatal rats and potential mechanisms. Methods Fifty healthy SD rats of 7 day-old were randomly divided into three groups: the sham operation group (n=10), the model group (n=20) and TTM treatment group (n=20), which received 3-day intraperitoneal injection of normal saline or ethanol extract of TTM respectively. TTC staining and Nissl staining were performed to detect the cerebral ischemia area and neuronal death. Western blot was used to detect the expression of Bcl-2 and Bax. Results The brain tissue of model group was slightly swollen, and white necrotic zone induced by ischemia occured on the right side of the brain, while the brain morphology of TTM treatment group was good. After TTC staining, ischemia zone was clearly seen on the right side of the brain in model group, while after TTM treatment, the size of ischemic zone was decreased. Compared with the model group , Nissl staining showed the neuronal cells increased in TTM treatment group. Western blot showed the expression of Bcl-2 protein in TTM group increased than that in HIBD model group (P<0.01),while the expression of Bax protein decreased (P<0.01). Conclusion TTM therapy is beneficial for HIBD,which may be related to reducing neuronal apoptosis.

TrilliumtschonoskiiMaxim.; neonatal rats; hypoxic-ischemic; brain damage; neuronal cells; apoptosis

2016-07-03，

2016-07-27

湖北省教育厅科研基金资助项目(No D200729005)；湖北民族学院科技学院自然科学项目(No KJZ201610)

邱 勇(1989-)， 男，硕士生，研究方向：中医药对神经疾病的研究，E-mail：backblack10@163.com；

刘 红(1963-)，男，教授，硕士生导师，研究方向：中药药理学，通讯作者，E-mail: 2548449651@qq.com；

时间：2016-10-20 10:29

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1086.R.20161020.1029.028.html

10.3969/j.issn.1001-1978.2016.11.014

A

1001-1978(2016)11-1548-05

R-332；R284.1；R322.81；R329.25；R338.1；R743.022；R743.053.1摘要:目的 探讨头顶一颗珠醇提物对新生大鼠缺血/缺氧性脑损伤(HIBD)的保护作用及可能机制。方法 50只7日龄SD大鼠随机分为假手术组(n=10)、模型组(n=20)、头顶一颗珠治疗组(n=20)，各组分别予以3 d相应的生理盐水及头顶一颗珠醇提物腹腔注射。分别通过氯化三苯基四氮唑(TTC)和尼氏染色检测脑缺血及神经细胞死亡情况，通过Western blot检测Bcl-2、Bax蛋白的表达。结果 HIBD模型组可见脑组织稍有肿大，且右侧脑部可见缺血的白色坏死区；治疗组可见大脑形态完好，未见明显肿胀及坏死，TTC染色后，模型组可见右侧脑部出现明显缺血区，经治疗后缺血区域减少。尼氏染色结果提示模型组可见神经元细胞减少，而治疗后神经元细胞增加。Western blot显示HIBD后Bcl-2表达减少(P<0.01)，Bax表达增加(P<0.01)，而经过头顶一颗珠治疗后，Bcl-2表达增加(P<0.01)，Bax表达降低(P<0.01)。结论 头顶一颗珠对HIBD具有保护作用，其机制可能与降低神经元细胞凋亡有关。

吴 昊(1986-)，男，硕士，研究方向：中药药理学，通讯作者，E-mail：3640689@qq.com