速效救心丸对大鼠血小板聚集率及环磷腺苷水平的影响

李益萍，罗良国，沈 磊，王肖龙



速效救心丸对大鼠血小板聚集率及环磷腺苷水平的影响

李益萍1，罗良国2，沈 磊2，王肖龙1

目的 探讨速效救心丸对血小板聚集的作用及机制。方法 采用比浊法测定速效救心丸、阿司匹林、阿魏酸哌嗪对二磷酸腺苷(ADP)、胶原和花生四烯酸(AA)诱导的大鼠血小板聚集率和环磷腺苷(cAMP)水平的影响。结果 与空白组比较，速效救心丸中、高剂量组可显著抑制ADP、胶原、AA诱导大鼠的血小板聚集(P<0.01)；速效救心丸高剂量组对AA诱导的大鼠血小板聚集抑制作用较阿司匹林组好；速效救心丸可提高大鼠血小板内cAMP的含量(P<0.05)。结论 速效救心丸能够抑制大鼠ADP、胶原和AA诱导的血小板聚集，其机制可能通过增加cAMP的含量而发挥作用。

速效救心丸；血小板聚集；环磷腺苷；阿司匹林

冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)是严重危害人类健康的常见病。血栓形成在CHD的发生发展中具有重要作用。 冠脉斑块破裂可引起血小板聚集，继发性血栓形成，致使血管阻塞和相关区域心肌缺血或坏死[1]。同时，冠脉介入治疗导致的内皮损伤，也可引起血小板激活，支架内血栓形成，为冠脉介入术后并发症。因此，运用抗血小板聚集药物是CHD或冠脉介入术后重要的治疗措施。然而，目前临床上常用的抗血小板药物如阿司匹林、氯吡格雷等因其不良反应或药物抵抗等，一定程度上影响了其临床运用及有效性。

因此，积极开展活血中药的抗血小板机制研究具有潜在的临床价值。

速效救心丸是治疗冠心病、心绞痛的常用药，具有行气活血，祛瘀止痛的作用。速效救心丸主要由川芎、冰片等组成，其有效成分或衍生物可抑制血小板聚集[2-4]。但速效救心丸对血小板功能的影响至今未见详细报道。本研究通过测定速效救心丸对血小板最大聚集率和血小板内环磷腺苷(cyclic adenosine monophosphate，cAMP)含量的影响，探讨速效救心丸对血小板聚集的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级别 Wistar雄性大鼠，280 g～320 g，北京维通利华有限公司动物养殖中心提供，所有大鼠分笼饲养于上海中医药大学实验动物中心。

1.1.2 药物和试剂 生理盐水、速效救心丸(天津中新药业集团股份有限公司第六中药厂生产，批号Z12020025)、阿司匹林(拜耳医药保健公司，批号13527270)、阿魏酸哌嗪片(成都亨达药业有限公司，批号151001)；二磷酸腺苷(ADP)、胶原、BSA、碳酸氢钠、氢氧化钠、氯化镁，花生四烯酸(AA)，EGTA，其他生化试剂均为国产分析纯；大鼠cAMP ELISA试剂盒(上海普盛生物科技有限公司)。

1.1.3 仪器和器材 Mettler-Toledc电子天平(上海梅特勒-托仪多公司)；TYXN-96多功能智能血液凝聚仪(上海通用)；Labsystems Multiskan MS Microplate Reader型酶标仪(芬兰制造)；Bio-RAD TC-20细胞计数仪(日本 Sysmex公司)；涡旋振荡器 votex-2(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)；eppendorf Centrifuge 5430R型离心机(德国eppendorf)；Beckman coulter离心机(美国贝克曼)；15 mL 硅化离心管(corning)；10 mL无菌注射器(上海康莱德企业发展集团股份有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 大鼠灌胃 Wistar大鼠36只(280 g～330 g)，据体重和随机数字表完全随机区组分组，分为6组，按人-动物药物剂量换算表予空白组(生理盐水2 mL)、阿司匹林组(20 mg/kg)、速效救心丸救心丸高剂量组(120 mg/kg)、速效救心丸中剂量组(60 mg/kg)、速效救心丸低剂量组(30 mg/kg)、阿魏酸哌嗪组(60 mg/kg)，灌胃7 d，最后一次灌胃半小时后取血。

1.2.2 大鼠腹主动脉取血 Wistar大鼠行3%戊巴比妥称定质量麻醉，剪开皮肤肌肉，找到腹主动脉，3.8%枸橼酸钠润洗的 10 mL 注射器，以腹主动分叉处向心端1 mm～3 mm处穿刺取血，取血后3.8%枸橼酸钠1∶9抗凝。

1.2.3 血小板的制备 取血后配平离心(1 000 r/min，8 min)取上清，为富血小板血浆(PRP)，其余血离心(3 000 r/min，15 min)取上清为贫血小板血浆(PPP)。

1.2.4 洗涤血小板的制备 PRP离心(2 500 r/min，10 min)，弃上清用改良台式缓冲液洗涤两次后定容吹打开(600 g，10 min)[5]，获得血小板悬浮液，经细胞计数仪使血小板计数调至4.5×108/mL。

1.2.5 加入不同诱导剂测血小板聚集率 采用比浊法在37℃条件下测定血小板聚集率。取 200 μLPRP， 分别加入 ADP(终浓度：15 μM)、胶原(终浓度：0.325 mg/mL)、AA(终浓度：0.05 mM)。血小板聚集率用血小板最大聚集率表示，结果用抑制率表示。 抑制率(%)=(空白组血小板聚集率—受试物处理组血小板聚集率)/空白组血小板聚集率×100%

1.2.6 血小板内cAMP含量测定 血小板悬液加入 ADP(终浓度：20 μM)诱导血小板聚集。5 min 后，加入 10 mM EDTA 终止反应，4 000 r/min，4℃离心 10 min，收集上清液。 -20℃冻存。cAMP 含量测定按照试剂盒说明书进行。

1.3 统计学处理 组间比较使用单因素方差分析。P<0.05表示有统计学意义，P<0.01表示具有显著差异。应用SPSS18.0软件进行统计分析，作图使用GraphPad Prism6.07软件。

2 结 果

2.1 各诱导剂对不同药物干预后大鼠血小板聚集率的影响 ADP诱导的血小板聚集率：速效高剂量组、阿魏酸哌嗪组与空白组比较有统计学意义(P<0.01)，并呈一定的量效关系趋势。胶原诱导的血小板聚集率：阿司匹林组、速效中高低剂量组、阿魏酸组与空白组比有统计学意义(P<0.01)。AA诱导的血小板聚集率：阿司匹林组、速效高剂量组、阿魏酸哌嗪组与空白组比有统计学意义(P<0.01)；速效低剂量组与速效高剂量组比有统计学意义(P<0.01)；速效中剂量组与速效高剂量组比较无统计学意义(P>0.05)。详见表1。

表1 各诱导剂对不同药物干预后大鼠的血小板聚集影响(±s)

2.2 各诱导剂对不同药物干预后大鼠血小板抑制率的影响(见图1) 阿司匹林组、速效高剂量组、速效中剂量组、速效低剂量组、阿魏酸哌嗪组对ADP诱导的大鼠血小板聚集的抑制率依次为9.05%、32.87%、11.84%、2.17%、27.55%；对胶原诱导的大鼠血小板聚集的抑制率依次为55.03%、30.31%、30.97%、21.89%、34.21%；对AA诱导的大鼠血小板聚集的抑制率依次为60.07%、72.42%、62.73%、10.86%、66.41%。阿司匹林对AA和胶原诱导的血小板聚集有较大的抑制作用，对ADP诱导的血小板聚集抑制作用较弱；高剂量速效救心丸及阿魏酸哌嗪对ADP、AA和胶原诱导的血小板聚集均有有较大的抑制作用；同时，速效救心丸对ADP、AA和胶原诱导的血小板聚集抑制率呈现一定的量效关系。

注：从左到右次序为阿司匹林组、速效救心丸高剂量组、速效救心丸中剂量组、速效救心丸低剂量组、阿魏酸哌嗪组。

图1 不同诱导剂对不同药物干预后血小板聚集抑制率的影响(n=6)

2.3 血小板内cAMP含量的测定(见图2) 模型组与空白组比存在统计学意义(P<0.05)，说明造模成功。

注：SXH为速效救心丸高剂量组；SXM为速效中剂量组；SXL为速效低剂量组；FA为阿魏酸哌嗪组；Blank为空白组；Control为空白组+20 μM ADP；其余各组均加入20 μM ADP。与空白组比，*P<0.05； 与对照组比，#P<0.05，## P<0.01。

图2 不同药物对血小板内cAMP的影响(n=6)

3 讨 论

冠脉斑块的破裂或PCI术导致的血管内皮受损，血小板在血管损伤部位的活化聚集，进而形成血栓[6]。AA、ADP以及血管内皮下暴露的胶原等诱导剂在血小板活化和聚集过程中起着重要的作用。cAMP是调节血小板功能的抑制性细胞内第二信使，细胞内cAMP水平增加，可以抑制血小板聚集，反之，则血小板聚集作用增强。AA代谢生成的血栓素A2(TXA2)和致密颗粒中释放的ADP与血小板表面相关受体结合，可使胞内cAMP浓度下降，引起血小板聚集，导致血栓形成[7-8]。目前临床上常用的抗血小板药物阿司匹林和P2Y12抑制剂氯吡格雷主要通过抑制AA和ADP途径起到抗血小板聚集作用，并已成为冠心病二级预防以及冠脉介入术后基础用药[9]。然而，这些药物的运用也存在一定的缺陷：不良反应较多(如出血、胃肠功能紊乱、变态反应、中毒反应、对肝肾的损害等)；由于多数药物作用途径单一，不能抑制其他血小板激活通路，可引起复发性缺血事件；部分病人会出现阿司匹林或/和氯吡格雷药物抵抗[10-11]。因此，研制出高效、安全性好的抗血小板药物一直是研究的热点。

中医药具有多方位、多靶点的干预作用特点，活血化瘀中药在临床上应用广泛并疗效确切，对中医药抗血小板聚集作用的深入研究具有积极的临床意义。

速效救心丸是临床效果确切的治疗冠心病经典中成药，研究表明其具有血管扩张、抗炎、抗氧化、调脂及促进血管新生的作用[12]，但对血小板功能影响的报道较少。本研究发现：①中、高剂量速效救心丸能够抑制大鼠ADP、胶原和AA诱导的血小板聚集，低剂量速效救心丸仅能抑制胶原诱导的血小板聚集。不同剂量的速效救心丸抗血小板聚集作用具有一定的量效关系。②与对照组相比，中、高剂量速效救心丸能够提高大鼠血小板内cAMP的含量，而低剂量速效救心丸有增高血小板内cAMP含量的趋势，且呈现一定的量效关系。提示速效救心丸可能通过cAMP途径起到抗血小板聚集的作用。③阿司匹林能够降低胶原和AA诱导的血小板聚集，但不能拮抗ADP诱导的血小板聚集。阿魏酸哌嗪能够抑制大鼠ADP、胶原和AA诱导的血小板聚集，其抑制疗效与高剂量速效救心丸相似，提示速效救心丸发挥抗血小板聚集作用可能与川芎的有效成分有关。阿司匹林与阿魏酸哌嗪均能提高大鼠血小板内cAMP的含量。速效救心丸能够抑制多种诱导剂引起的血小板聚集，在本实验中高剂量组对AA诱导的血小板聚集率显示最强的抑制作用。

速效救心丸能够抑制大鼠ADP、胶原和AA诱导的血小板聚集，其机制可能通过增加cAMP的含量而起到抑制血小板活化的作用。速效救心丸抑制血小板聚集作用呈现多环节、多靶点的特点，为其冠心病临床治疗提供了新的理论依据。

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(本文编辑王雅洁)

国家自然科学基金项目(No.8157364)；上海市中医临床重点实验室(No.14D Z2273200)；上海市科委课题(No.14401972202)

1.上海中医药大学附属曙光医院(上海201203)；2.上海市浦东新区唐镇社区卫生中心

王肖龙，E-mail：wxlqy0214@163.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1672-1349.2016.15.010

1672-1349(2016)15-1729-04

2016-04-22)