Survivin对体外培养胶质瘤细胞U251替莫唑胺敏感性的影响

王鹏 张剑宁 陈金辉 于新 赵虎林 孙艳杰

(海军总医院神经外科，北京 100037)

·论著·

Survivin对体外培养胶质瘤细胞U251替莫唑胺敏感性的影响

王鹏 张剑宁*陈金辉 于新 赵虎林 孙艳杰

(海军总医院神经外科，北京 100037)

目的探讨Survivin对体外培养的人脑胶质瘤细胞(U251)替莫唑胺化疗敏感性的影响。方法将人脑胶质瘤细胞U251中Survivin的表达上调或者抑制后，经替莫唑胺处理。采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法，平板克隆形成试验评价各组细胞增殖能力，流式细胞仪检测细胞凋亡，蛋白免疫印迹法检测各组细胞激活caspase-3的表达情况。结果替莫唑胺处理后，与亲代细胞相比，下调Survivin的表达，细胞的生长抑制效果增强，凋亡率增加，激活的caspase-3蛋白表达增多；上调Survivin的表达，细胞生长抑制作用减弱，凋亡率减少，激活的caspase-3蛋白表达下降。结论Survivin可通过抑制凋亡，影响胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性。

胶质瘤; 细胞凋亡; 替莫唑胺; 存活素

胶质母细胞瘤占胶质瘤的50%以上，并且是致死性最高的恶性肿瘤之一[1]。在美国每年大约有10 000人诊断为胶质母细胞瘤；经过手术、放疗、化疗等综合治疗后，患者的中位生存时间为14.6月[2]。与其他肿瘤相比，胶质瘤的治疗进展相对滞后，除了将替莫唑胺(temozolomide,TMZ)引入到胶质瘤的治疗之外，临床上目前暂无其他可以提高胶质瘤治疗效果的方法。替莫唑胺是一种口服的烷化剂，通过干扰肿瘤细胞DNA的复制并导致肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖，进而提高患者的存活时间[3,4]。替莫唑胺作为胶质母细胞瘤治疗的一线用药应用广泛，但是替莫唑胺耐药性的产生降低了其在临床上的治疗效果[5]，因此亟需研究替莫唑胺耐药的相关机制并加以干预，提高胶质母细胞瘤的治疗效果。

虽然化疗药物导致肿瘤细胞死亡有多种方式，诸如坏死、有丝分裂破坏、自噬等，但是诱导凋亡仍是化疗药物导致肿瘤细胞死亡的主要方式[6,7]。Survivin在肿瘤细胞的凋亡中发挥重要作用，因此本实验拟观察Survivin对替莫唑胺诱导胶质瘤细胞凋亡的影响，分析Survivin对胶质瘤细胞替莫唑胺敏感性的影响。

材料与方法

一、材料

U251胶质母细胞瘤细胞，Survivin的表达质粒和干扰质粒均由第四军医大学西京脑科医院章翔教授惠赠。改良Eagle培养基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)购自Hyclone公司，胎牛血清购自Gibco公司，兔抗人Caspase-3单克隆抗体、山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶标记购自Cell Signaling公司，兔抗人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗体购自北京博奥森公司，TMZ购自天士力公司。

二、方法

1.细胞培养：替莫唑胺10 mg用250 μl二甲亚砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)溶解，经DMEM培养基稀释(DMSO浓度不超过0.5%)，配制成替莫唑胺浓度为1 000 μmol/L的母液；人胶质母细胞瘤系U251细胞用含10 ml/L胎牛血清的DMEM培养基，在37℃、含5% CO2的孵箱中培养。

2.稳转细胞系的建立：将U251细胞分别转染pcDNA3.1(空载体)，pcDNA3.1-Survivin(Survivin的表达载体)，采用G418筛选，构建的稳定转染细胞命名为：U251/PCtrl-1，U251/Sur。将U251细胞分别转染pRNAT(空载体)、pRNAT-SurvivinshRNA[针对Survivin基因的短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)真核表达载体]、pRNAT- NS si[无关序列(nonsense sequence，NS)载体]，采用G418筛选，构建的稳定转染细胞系命名为：U251/PCtrl-2，U251/Sur si和U251/NS si。

3.四甲基偶氮唑蓝(methyl thiazolylterrazaium,MTT)法测定细胞生长曲线：将处于对数生长期的U251、U251/PCtrl-1、U251/PCtrl-2、U251/Sur、U251/Sur si、U251/NS si细胞，以每孔接种1×104个细胞的浓度，接种至24孔板，每孔加 1 ml DMEM，每组细胞接种9孔，1 d后(细胞贴壁)分别加替莫唑胺，使TMZ的浓度为100 μmol/L。在接种的第2天、第4天、第6天，每组细胞各取3孔计数，以MTT法，测定各组的光密度值，绘制细胞生长曲线。

4.平板克隆形成实验：分别取处于对数生长期的U251、U251/PCtrl-1、U251/PCtrl-2、U251/Sur、U251/Sur si、U251/NS si细胞，以每个培养皿接种200个细胞的浓度，将上述细胞接种至60 mm的培养皿中，加入10 ml的 DMEM。1 d后(细胞贴壁)分别加替莫唑胺，使TMZ的浓度为100 μmol/L。10 d后，弃去上清，以磷酸盐缓冲溶液(phosphate buffer saline,PBS)轻柔洗涤后，以5 ml纯甲醇固定细胞，之后弃去固定液，以姬姆萨应用液染色，用自来水洗去染色液，将培养皿放置在空气中干燥后，用肉眼计数细胞的克隆数。克隆形成率=克隆数/200×100%。

5.流式细胞术(flow cytometry,FCM)检测细胞凋亡：将处于对数生长期的U251、U251/PCtrl-1、U251/PCtrl-2、U251/Sur、U251/Sur si、U251/NS si细胞接种于100 ml培养瓶中，1 d后(细胞贴壁)分别加替莫唑胺，使TMZ的浓度为100 μmol/L，细胞接种5 d后(加入TMZ 4 d后)，收集细胞，用流式细胞仪检测细胞的凋亡水平。

6.蛋白质免疫印迹检测Caspase-3表达：各组细胞经替莫唑胺处理后，裂解细胞提取蛋白，并行蛋白定量。将蛋白电泳后转移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上，洗膜后加入膜封闭液室温封闭1 h，加入稀释的兔抗人Caspase-3单克隆抗体，4℃冰箱过夜，漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG，室温孵育1 h，漂洗后电化学发光(electrochemiluminescence,ECL)曝光定影。

7.统计学分析：采用SPSS 14.0进行统计学分析，用均数±标准差的形式表示细胞计数、细胞克隆计数、凋亡率；采用方差分析比较各组细胞的细胞均数、细胞克隆形成率、凋亡率，组间均数的比较用q检验。Plt;0.05定为有统计学意义。

结 果

一、不同稳转细胞系中Survivin的表达情况

稳定转染干扰载体的U251/ Sursi细胞中Survivin表达明显抑制，稳定转染Survivin的U251/Sur细胞中Survivin呈高表达。

二、不同稳转细胞的生长曲线

经替莫唑胺处理后，与亲代U251(U251/Ctrl)细胞相比，U251/ Sur si细胞生长降低(Plt;0.01,图1)；经替莫唑胺处理后，与亲代U251(U251/Ctrl)细胞相比，U251/ Sur细胞生长抑制减弱(Plt;0.01,图1)。

三、细胞克隆计数

经替莫唑胺处理后，与亲代U251(U251/Ctrl)细胞相比，U251/ Sur si细胞克隆数减少 (Plt;0.01,图2)；经替莫唑胺处理后，与亲代U251(U251/Ctrl)细胞相比，U251/ Sur细胞克隆数增多(Plt;0.01,图2)。

四、不同稳转细胞的凋亡情况

经替莫唑胺处理后，与亲代U251(U251/Ctrl)细胞相比，U251/Sur si细胞凋亡增多(Plt;0.01,图3)；与亲代U251(U251/Ctrl)细胞相比，U251/ Sur细胞凋亡减少(Plt;0.01,图3)。

图1 不同稳转细胞的生长曲线
Fig 1 Growth curve of U251 cells in different groups

aPlt;0.01,TMZ+SursivsTMZ;bPlt;0.01,TMZ+SurvsTMZ.

图2 各组细胞克隆形成率
Fig 2 Cell surviving fraction of U251 cells in different groups

aPlt;0.01,TMZ+SursivsTMZ;bPlt;0.01,TMZ+SurvsTMZ.

图3 各组细胞凋亡水平
Fig 3 Apoptosis of U251 cells by flowcytometry

aPlt;0.01,TMZ+SursivsTMZ;bPlt;0.01,TMZ+SurvsTMZ.

五、Western blot检测Caspase-3表达结果

Western blot分析结果：经替莫唑胺处理后，与亲代U251(U251/Ctrl)细胞相比，U251/Sur si中Caspase-3蛋白表达增加(图4)；与亲代U251(U251/Ctrl)细胞相比，U251/Sur中Caspase-3表达降低(图4)。

图4 各组细胞Caspase-3表达水平
Fig 4 Expression of Caspase-3 protein in each group by Western blot

讨 论

胶质母细胞瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，经过正规的手术、放疗及化疗，超过90%的患者在2年内死亡。TMZ是第二代烷化剂，作为胶质母细胞瘤化疗的一线用药，目前广泛使用。对于新诊断的胶质母细胞瘤患者而言，与手术联合应用，或者与手术及放疗联合应用，可以极大提高患者的存活时间。但是在替莫唑胺的治疗过程中肿瘤细胞可逐步产生耐药性，即使初始治疗时对替莫唑胺反应良好的患者，肿瘤细胞仍可逐步获得耐药性[8～10]。因此研究胶质瘤细胞对替莫唑胺耐药的机制并加以干预，有望提高胶质母细胞瘤患者的治疗效果。

研究表明诱导凋亡是化疗药物杀灭肿瘤细胞的重要机制，化疗药物通过损伤DNA，进而诱发凋亡导致细胞死亡[11]，因此研究凋亡通路上的相关分子及作用，有望提高胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性[12]。以往的研究表明，促进细胞凋亡可以增加胶质母细胞瘤对替莫唑胺的敏感性[13]。抑制抗凋亡的Bcl-2功能，可促进细胞死亡，在一项Ⅰ期临床试验中，将Bcl-2的抑制剂AT-101与替莫唑胺联合应用治疗胶质瘤，患者的中位生存时间达到18.2个月[14]。

Survivin在细胞凋亡中发挥重要作用，且与肿瘤发生、发展关系密切，并且其在正常脑组织中不表达或低表达，而在胶质瘤组织中高表达，随着胶质瘤级别的增高，Survivin的表达也随之增高，上述特点均提示Survivin非常适合做为胶质瘤靶向治疗的靶点[15]。本研究发现下调胶质瘤细胞中Survivin的表达，可使替莫唑胺诱导的胶质瘤细胞的凋亡增加，上调胶质瘤细胞中Survivin的表达，可使替莫唑胺诱导的胶质瘤细胞凋亡减少，提示Survivin可通过影响细胞凋亡，进而影响胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性。目前Survivin的抑制剂已经进入Ⅰ期临床试验，随着Survivin抑制方案的逐步成熟，有望最终提高胶质瘤患者的治疗效果，延长患者的生存时间。

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EffectsofSurvivinontemozolomidechemosensitivityofU251gliomacellsinvitro

WANGPeng,ZHANGJianning,CHENJinhui,YUXin,ZHAOHulin,SUNYanjie

DepartmentofNeurosurgery,NavyGeneralHospital,Beijing100037,China

ObjectiveThe effect of Survivin on temozolomide (TMZ) resistance of U251 glioma cells is discussed.MethodsThe Survivin RNA plasmids or the specific shRNA vector targeting Survivin was transfected into U251 cells,respectively. The cellular growth activity was assayed by methyl thiazolyltetrazolium(MTT). Cell surviving fraction was calculated by colony forming assay. The apoptosis was assayed by the Annexin V assay by flow cytometer (FCM). The expression of activated caspase-3 was detected by western blot.ResultsAfter treated with TMZ,compared with parent cells,cell proliferation was inhibited significantly,apoptosis rate was increased,and the expression of activated caspase-3 protein was promoted in down-regulation Survivin group; while in up-regulation Survivin group,cell proliferation was promoted,apoptosis rate was decreased,and the expression of activated caspase-3 protein was declined.ConclusionSurvivin can suppress TMZ sensitivity of glioma cells by inhibiting the apoptosis in vitro.

Glioma; Apoptosis; Temozolomide; Survivin

1671-2897(2016)15-317-04

R 739.41

A

王鹏，博士，E-mail:986257010@qq.com

*通讯作者：张剑宁，教授，博士生导师，E-mail：jnzhang2005@yahoo.com.cn

2015-10-10；

2016-01-06)