一种针对马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)的无痕基因组改造方法

郭 超,陈勇毅,周峻岗,余 垚,吕 红

(1. 复旦大学 生命科学学院 遗传工程国家重点实验室,上海 200438;2. 上海工业菌株工程技术研究中心,上海 200438)



一种针对马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)的无痕基因组改造方法

郭 超1, 2,陈勇毅1, 2,周峻岗1, 2,余 垚1, 2,吕 红1, 2

(1. 复旦大学 生命科学学院 遗传工程国家重点实验室,上海 200438;2. 上海工业菌株工程技术研究中心,上海 200438)

马克斯克鲁维酵母位于酵母科克鲁维属, 具有高分泌能力、高生长速率、多底物利用以及耐高温等特点, 具有工业应用前景. 因此, 建立马克斯克鲁维酵母的基因工程改造技术十分重要. 本文以马克斯克鲁维酵母URA3基因缺陷菌株为出发菌株, 依据同源重组原理, 选用KmURA3作为可循环使用的筛选标签基因, 建立了一种针对马克斯克鲁维酵母的无残留多基因敲除技术, 以满足其遗传工程改造的需求. 本研究利用这种技术成功构建了Kmhis3Δ、Kmura3Δhis3Δ、Kmura3Δade2Δ、Kmura3Δhis3Δade2Δ、Kmhis3Δade2Δ等5株营养缺陷型菌株, 为马克斯克鲁维酵母的分子遗传学研究以及工业应用研究提供了遗传材料.

马克斯克鲁维酵母； 多基因敲除；KmURA3基因；KmHIS3基因；KmADE2基因

马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus), 属于酵母科克鲁维属, 像酿酒酵母一样, 是食品安全级酵母, 并通过了美国GRAS(Generally Regarded as Safe)和欧洲QPS(Qualified Presumption of Safety)食品安全认证[1]. 马克斯克鲁维酵母具有生长快、耐高温、可利用多种糖类作为碳源等生理生化特点[2-3], 自身还能分泌产生多种蛋白酶, 如菊粉酶[4]、β-半乳糖苷酶[5]、羰基还原酶[6]、β-葡萄糖苷酶[7]、β-木糖苷酶[8]等水解酶类, 因此在利用菊粉[9]、乳清[10]、木质纤维素[11-12]等廉价原料生产乙醇方面具有良好应用前景. 此外, 利用基因工程技术, 实现了多种异源蛋白在K.marxianus中的表达, 如α-半乳糖苷酶[13]、乳糖脱氢酶[14]、耐热纤维素酶[15]等. 因此,K.marxianus在乙醇发酵、外源蛋白表达等方面表现出很好的工业应用潜力.

为了更好地开展K.marxianus工业应用研究, 需要建立适合K.marxianus的遗传操作体系, 实现在酵母基因组上的遗传操作. 2007年 Ribeiro等首次将Cre-LoxP系统应用于K.marxianus, 并成功实现了K.marxianus基因组上的LAC4(β-半乳糖苷酶基因)双拷贝基因的敲除[16]. 但利用Cre-LoxP敲除基因组上的DNA序列时, 需要进行两次转化, 操作较复杂, 同时还会在基因组上残留外源DNA片段. 在K.marxianus基因组上进行外源基因整合研究方面, Abdel-Banat等在K.marxianus中敲除了非同源末端连接途径相关基因KU70, 提高了外源基因随机插入基因组的效率[17]. 也有研究报道通过利用URA3作为筛选标签, 将外源基因非靶向性随机插入K.marxianus基因组实现外源基因表达[14-15,18]. 上述这些研究主要以非靶向性随机插入基因组为主.

本研究利用同源重组原理, 选择KmURA3作为可循环使用的筛选标签, 在K.marxianus中建立了一种无痕基因组改造方法.URA3基因编码的乳清苷5-磷酸脱羧酶, 能将5-FOA(5-氟乳清酸) 转化成对细胞生长有害的物质, 因此含有URA3基因的酵母细胞无法在含有5-FOA的培养基上生长. 利用URA3作为营养缺陷筛选标记时, 既可以实现对基因组目标序列的敲除, 又可以通过同源重组和反筛的并用, 实现URA3筛选标签基因的脱落. 应用这种方法敲除基因组基因时, 不会残留外源DNA片段, 同时又能实现标签基因的再利用. 应用该方法, 我们成功构建了Kmura3Δhis3Δ、Kmura3Δade2Δ、Kmura3Δhis3Δade2Δ、Kmhis3Δ、Kmhis3Δade2Δ等基因工程宿主菌株.

1 材料与方法

1.1 材料

K.marxianusFIMURA3基因缺陷菌株Kmura3Δ, 基因型：ura3Δ(190-352);K.marxianusFIM野生菌株; 大肠杆菌E.coliDH5α; 质粒构建载体pMD-18T均为本实验室保存.

PCR扩增使用KOD酶试剂盒购自TOYOBO. 多片段一步酶连法构建质粒[19]所用试剂盒(一步法克隆试剂盒)购自美国Yeasen. 各种限制性内切酶、T4DNA连接酶等均购自TaKaRa公司. PCR引物、DNA测序由上海杰李生物技术有限公司完成. Yeast Extract购自德国Merk公司. Bacto-Agar, Yeast Nitrogen Base W/O Amino Acids(YNB)购自美国DIFICO公司. 5-FOA为U.S.Biological 公司产品. 各种培养基氨基酸购自国药集团化学试剂有限公司. YPD培养基：1%酵母提取物, 2% 蛋白胨, 2% 葡萄糖. SC-Uracil培养基：0.67%YNB, 2%葡萄糖, 不含Uracil(尿嘧啶)的混合氨基酸. SC-Histidine培养基：0.67% YNB, 2%葡萄糖, 不含Histidine(组氨酸)的混合氨基酸. SC-Adenine培养基：0.67% YNB, 2%葡萄糖, 不含Adenine(腺嘌呤)的混合氨基酸. YPD+5-FOA培养基：YPD培养基, 0.5% 5-FOA.

1.2 方法

1.2.1K.marxianus基因组抽提

本研究中酵母基因组提取采用珠磨法[20]. 取3mL对数生长期酵母菌菌液, 离心收集菌体后分别加入250μL DNA裂解液, 250μL苯酚/氯仿/异戊醇混合液(体积比25∶24∶1), 0.3g玻璃珠(直径0.3～0.5mm), 漩涡震荡1min; 12000r/min离心3min, 取上清, 加入550μL氯仿/异戊醇混合液(体积比24∶1), 上下混匀后8000r/min 离心3min; 取上清, 加入两倍体积无水乙醇, -20℃静置30min; 8000r/min 离心5min, 沉淀物用70%乙醇洗两次, 70℃烘干后溶于50μL TE, -20℃保存.

1.2.2 酵母DNA序列克隆与基因敲除盒的构建

从K.marxianus基因组敲除的的基因有：KmHIS3、KmADE2. 依据NCBI已公布的K.marxianusDMKU3-1042 基因组信息(DBLINK-BioProject：PRJDA65233)设计引物(表1). 引物由上海杰李生物技术有限公司合成.

选用KmURA3为筛选标签基因, 以K.marxianus基因组为模板, PCR扩增获得KmURA3 ORF 1430bp 标签基因. 构建KmHIS3基因中断盒pMD-18This3Δ∶∶URA3-cas, 以K.marxianus基因组为模板PCR扩增KmHIS3 ORF上下游片段, 分别命名：HIS3_up、HIS3_down1、HIS3_down2. HIS3_up为KmHIS3 ORF上游607bp DNA片段, HIS3_down1、HIS3_down2分别为KmHIS3 ORF下游 565bp 和604bp DNA片段, HIS3_down1和HIS3_down2为同源序列. 将上述HIS3_up、HIS3_down1、KmURA3、HIS3_down2 DNA片段和PstⅠ、SmaⅠ双酶切获得的pMD-18T线性化载体片段进行多片段一步酶法[19]连接, 转化E.coliDH5α感受态细胞, 抽提质粒. 构建获得KmHIS3基因敲除中断盒pMD-18This3Δ∶∶URA3-cas.

同样的方法构建KmADE2基因敲除中断盒pMD-18Tade2Δ∶∶URA3-cas, PCR扩增KmADE2 ORF上下游片段：ADE2_up、ADE2_down1、ADE2_down2. ADE2_up为KmADE2 ORF上游722bp DNA, ADE2_down1、ADE2_down2分别为KmADE2 ORF下游617bp和693bp DNA片段, 其中ADE2_down1和ADE2_down2为同源序列. 将上述ADE2_up、ADE2_down1、KmURA3、ADE2_down2 DNA片段和PstⅠ、SmaⅠ双酶切获得的pMD-18T线性化载体片段进行多片段一步酶法[19]连接,转化E.coliDH5α感受态细胞, 抽提质粒, 构建获得KmADE2基因敲除中断盒pMD-18Tade2Δ∶∶URA3-cas.

构建获得的pMD-18This3Δ∶∶URA3-cas、pMD-18Tade2Δ∶∶URA3-cas质粒送上海杰李生物技术有限公司, 使用通用引物M13F/M13R测序鉴定.

表1 本实验所用引物序列

注：下划线“__” 标记部分为根据多片段一步酶连法[19]在引物5’端设计的同源序列.

1.2.3 酵母电转化

敲除目的基因线性化DNA片段是通过电转化方法来转化K.marxianus出发菌株[14,21]. 平板挑单克隆于50mL YPD培养基过夜培养至OD600为1.2, 8000r/min离心10min收集菌体; 2mL 2mol/L HEPES、2mL 1mol/L山梨醇(Sorbitol)和0.5mL 1mol/L DTT混合悬浮菌体, 30℃水浴30min; 8000r/min 离心10min, 去上清; 20mL去离子水漂洗两次, 20mL 1mol/L山梨醇漂洗两次; 8000r/min 离心10min, 去上清; 10mL 1mol/L山梨醇悬浮菌体, 取160μL菌液和1～2μg线性化DNA片段混合后置于电转杯电击; 电击条件：1.5kV, 25μF, 500 Ω; 电击后随即30℃孵育4h, 涂布于培养基平板. 以上电转化所有操作在冰上进行.

1.2.4 酵母基因组基因的敲除

KmHIS3基因中断盒pMD-18This3Δ∶∶URA3-cas用BamHⅠ和KpnⅠ双酶切, 获得his3Δ∶∶URA3 cassette线性化DNA, 电转化Kmura3Δ菌株, 涂布SC-Uracil平板, 30℃培养48h, 在Uracil缺陷培养基平板上生长正常的单克隆, 即为可能的阳性克隆.

挑选可能的阳性克隆转接SC-Histidine平板, 30℃培养12h后, 若无克隆生长, 则提示测试的克隆子中, 线性化片段中的HIS3_up、HIS3_down2和基因组KmHIS3基因同源部分发生同源重组,KmURA3插入到KmHIS3基因座, 获得敲除KmHIS3的工程菌株ura3Δhis3Δ∶∶URA3.

类似地, 用SphⅠ和KpnⅠ双酶切KmADE2中断盒pMD-18Tade2Δ∶∶URA3-cas, 获得ade2Δ∶∶URA3 cassette线性化DNA, 分别电转化Kmura3Δ菌株和Kmura3Δhis3Δ菌株, 在SC-Uracil筛选, 分别获得KmADE2基因敲除工程菌株Kmura3Δade2Δ∶∶URA3和Kmura3Δhis3Δade2Δ∶∶URA3.

1.2.5 标签基因的循环利用

Kmura3Δhis3Δ∶∶URA3工程菌株在SC-Uracil液体培养基中培养至对数生长期(OD600为0.6～1.0), 取100μL菌液涂布于YPD+5-FOA平板, 30℃培养12h, 正常生长的单菌落应为ura3Δhis3Δ工程菌株. 在其基因组KmHIS3基因座上插入的his3Δ∶∶URA3中HIS3_down1和HIS3_down2发生内源性同源重组,KmURA3筛选标签基因脱落, 可以实现KmURA3的循环再使用, 同时在敲除KmHIS3位置无外源DNA片段残留.

用同样的方法, 将包含筛选标签基因KmURA3的Kmura3Δhis3Δade2Δ∶∶URA3、Kmura3Δade2Δ∶∶URA3菌株涂布YPD+5-FOA平板, 30℃培养12h, 获得正常生长的单菌落, 即KmURA3筛选标签基因脱落, 构建获得无外源DNA片段残留的KmADE2敲除菌株Kmura3Δhis3Δade2Δ和Kmhis3Δade2Δ .

2 结果与分析

2.1KmHIS3、KmADE2基因敲除中断盒的构建

为了构建KmHIS3中断盒(图1(a)), 使用KmURA3作为筛选标记, 在Kmura3Δ菌株中敲除KmHIS3(图2(a)).以酵母基因组为模板, PCR扩增获得HIS3_up、HIS3_down1、KmURA3、HIS3_down2片段(图1(a), 图2(a)), 凝胶DNA回收试剂盒回收PCR产物, 与PstⅠ、SmaⅠ双酶切获得的pMD-18T线性化载体片段进行多片段一步酶法连接[19]. 构建获得KmHIS3基因中断盒pMD-18This3Δ∶∶URA3-cas(图1(b)).BamHⅠ、KpnⅠ双酶切pMD-18This3Δ∶∶URA3-cas, 获得his3Δ∶∶URA3 cassette线性化DNA(图1(a)). 同样方法, PCR扩增获得ADE2_up、ADE2_down1、KmURA3、ADE2_down2(图1(c)), 将上述凝胶DNA回收后和PstⅠ、SmaⅠ双酶切获得的pMD-18T线性化载体片段进行多片段一步酶法[19]连接. 获得KmADE2基因敲除中断盒pMD-18Tade2Δ∶∶URA3-cas(图1(d)).SphⅠ、KpnⅠ双酶切pMD-18Tade2Δ∶∶URA3-cas, 获得ade2Δ∶∶URA3 cassette线性化DNA(图1(c)).

2.2 宿主菌Kmura3Δhis3Δ的构建与鉴定

his3Δ∶∶URA3 cassette线性化DNA转化Kmura3Δ菌株后, 涂布于SC-Uracil平板, 30℃培养48h.如图2(b)上所示, 转化子在SC-Uracil培养基上可以生长, 而在SC-Histidine的培养基上不能生长, 说明his3Δ∶∶URA3 cassette线性化片段同源重组插入到Kmura3Δ基因组的KmHIS3基因座上, 构建获得了Kmura3Δhis3Δ∶∶URA3菌株(图2(a)).

为了丢掉筛选标记KmURA3, 实现KmURA3的循环利用, 将Kmura3Δhis3Δ∶∶URA3菌株涂布于YPD+5-FOA平板, 30℃培养过夜(图2(b)中). 在YPD+5-FOA能正常生长的单菌落, 说明在Kmura3Δhis3Δ∶∶URA3菌株中, HIS3_down1和HIS3_down2发生内源性同源重组,KmURA3标签基因脱落(图2(a)). 将在YPD+5-FOA生长的单克隆分别接种SC-Uracil和SC-Histidine培养基, 均不能生长(图2(b)下), 提示构建获得无外源DNA残留的Kmura3Δhis3Δ双基因缺失菌株.

进一步, 利用PCR方法对Kmura3Δhis3Δ双基因缺失菌株进行验证. 在KmHIS3基因敲除区域上下游设计引物F1：CGTGCACATGAGAATATTTCTTCTTAAACC,R2：TTACATCAAAACTCCT-TTGGTAGATGGAAC,如图2(a)所示, 用F1/R1引物进行扩增, 获得951bp片段(图3), 与预测片段大小一致. 对凝胶电泳目的条带进行DNA回收并送测序, 测序结果进行比对,Kmura3Δhis3Δ菌株的his3基因在其CDS 234～483区域缺失250bp(图4), 成功构建获得Kmura3Δhis3Δ双基因缺失菌株.

2.3 宿主菌Kmura3Δhis3Δade2Δ、Kmura3Δade2Δ的构建与鉴定

SphⅠ、KpnⅠ双酶切KmADE2中断盒pMD-18Tade2Δ∶∶URA3-cas获得的ade2Δ∶∶URA3 cassette线性化DNA, 分别电转化缺陷菌株Kmura3Δhis3Δ和Kmura3Δ, 分别涂布SC-Uracil培养基. 转化子在SC-Uracil 培养基上可以生长, 而在SC-Adenine培养基上不能生长, 则获得Kmura3Δhis3Δade2Δ∶∶URA3和Kmura3Δade2Δ∶∶URA3菌株.

为了实现KmURA3标签基因的掉落和循环使用, 将Kmura3Δhis3Δade2Δ∶∶URA3和Kmura3Δade2Δ∶∶URA3菌株分别涂布YPD+5-FOA培养平板, 正常生长的单菌落提示KmURA3标签基因掉落. 随后, 将5-FOA平板上生长的单克隆分别接种在 SC-Uracil、SC-Histidine、SC-Adenine培养基上, 均不能生长的克隆(图5(a)，见第582页), 可能是无外源DNA残留的三基因缺失菌株Kmura3Δhis3Δade2Δ. 在SC-Uracil、SC-Adenine培养基上均不能生长的克隆(图6(a)，见第582页), 可能是无外源DNA残留的双基因缺失菌株Kmura3Δade2Δ.

进一步使用PCR方法对Kmura3Δhis3Δade2Δ、Kmura3Δade2Δ菌株进行验证, 在KmADE2基因同源序列ADE2_up上游和ADE2_down2下游设计引物F2：ATGGACCAAGAACTGTTGGTATTT-TAGG,R2：TTATTTCCTCAAATATTCTTGGTATCCG.使用引物F2/R2扩增获得大小1601bp片段, 和预测片段大小一致(图5(b), 图6(b)). 对凝胶电泳目的条带进行DNA回收并送测序, 测序结果与野生菌株KmADE2序列进行比对,Kmura3Δhis3Δade2Δ、Kmura3Δade2Δ菌株的ade2基因序列在其CDS 774～893区域缺失120bp(图7，见第582页), 成功构建获得无外源DNA残留的三基因缺失菌株Kmura3Δhis3Δade2Δ和双基因缺失菌株Kmura3Δade2Δ.

2.4 宿主菌Kmhis3Δ 、Kmhis3Δade2Δ的构建与鉴定

在Kmura3Δhis3Δ、Kmura3Δhis3Δade2Δ的基础上, 为了获得Kmhis3Δ、Kmhis3Δade2Δ工程菌株, 我们用同源重组的方法在KmURA3基因座上进行了KmURA3基因的回补.

本研究在KmURA3 ORF上下游设计引物(表1), PCR扩增获得包含KmURA3 ORF的1430bp回补DNA(Chromosome1：1542629～1544057, 1430bp). 将上述KmURA3回补DNA电转化Kmura3Δhis3Δ菌株, 30℃培养48h后, 转化子在SC-Uracil培养基上正常生长, 而在SC-Histidine培养基上不能生长(图8(a)), 提示构建获得无外源DNA残留的单基因敲除菌株Kmhis3Δ.

进一步通过PCR方法验证Kmhis3Δ菌株, 在KmURA3回补片段上下游设计引物, F3：TTGGGACTCCAAAACTTATATTTTGAACG, R3：TCCGAGTACACACGAACCTCTTGTTCTCGG. 使用引物F3/R3扩增获得1630bp片段, 和预测片段大小一致(图8(b)). 成功构建获得单基因缺失菌株Kmhis3Δ.

同样的方法构建Kmhis3Δade2Δ.KmURA3回补DNA电转化Kmura3Δhis3Δade2Δ后, 转化子在SC-Uracil培养基上生长, 而在SC-Histidine、SC-Adenine培养基上不能生长(图9(a)), 提示构建获得Kmhis3Δade2Δ. 进一步PCR方法验证Kmhis3Δade2Δ, 使用F3/R3引物扩增获得1630bp片段, 与K.marxianusFIM野生菌株基因组为模板对照组相比, 片段大小一致(图9(b)). 成功构建获得无外源DNA残留的双基因缺失菌株Kmhis3Δade2Δ.

2.5 无残留多基因敲除方法的效率

根据本研究实验数据统计结果, 无残留多基因敲除方法构建K.marxianus多基因缺失菌株时, 电转化靶基因中断盒线性化 DNA片段的转化率维持在每μg DNA 52～72个转化子(表2).

表2 K.marxianus FIM多基因敲除菌株构建效果

注：基因靶向敲除平均效率：36.112%;KmURA3回补平均效率：100%.

由于K.marxianus菌株非同源重组的高活性[14, 17], 在以KmURA3为筛选标签敲除目的基因时, 比较电转化后SC-Uracil筛选数据和敲除靶基因相应营养缺陷培养基筛选数据发现靶基因中断盒线性化 DNA准确插入基因组靶基因位置的平均准确率为36.112%(表2). 这说明靶基因中断盒线性化 DNA在一定程度上也会以非同源末端连接的机体修复机制随机插入基因组, 从而使菌株获得标签基因的同时目的基因不发生缺失突变.

而5-FOA药物筛选无痕靶基因敲除菌株时, 在5-FOA筛选平板上随机选取16个单克隆进行后续相应营养缺陷培养基鉴定和PCR验证, 发现内源同源重组实现KmURA3标签基因掉落的菌株筛选准确率高达100%.

有趣的是, 根据本研究统计数据来看KmURA3靶向回补多基因缺失菌株基因组的SC-Uracil准确率很高, 并没有明显的非同源随机插入基因组现象. 这可能和KmURA3回补DNA片段的基因功能区完整性以及同源区序列较长有关.

3 讨 论

虽然K.marxianus工业化应用潜力巨大, 但是目前适用于K.marxianus的分子遗传学操作方法并不多,K.marxianus遗传分子机制研究和遗传工程改造研究也远远落后于其他常规酵母. 目前关于K.marxianus分子遗传学操作的报道包括Cre-LoxP系统和URA3筛选标签[2], 而Cre-LoxP系统实验操作较复杂且实验周期长[16],URA3筛选标签也多用于外源基因非同源随机插入整合基因组方面的研究[14-15,18].

本研究利用URA3的反向筛选特点[22], 选用KmURA3作为筛选标签基因, 根据同源重组原理建立了可用于K.marxianus的多基因敲除技术. 通过一次转化, SC-Uracil和5-FOA药物两次筛选即可获得在基因组上无外源DNA残留、同时敲除靶基因的菌株, 相比Cre-LoxP系统实验操作更加方便. 本研究也引入了多片段一步酶法[19]构建靶基因敲除盒, 大大缩短了构建多基因敲除菌株的周期. 使用该方法进行K.marxianus基因敲除时, 关键在于敲除靶基因同源DNA序列GENE_up、GENE_down1和GENE_down2的设计. 原则上, GENE_up、GENE_down1和GENE_down2的设计主要以考虑靶基因敲除区域为主, 其中GENE_up为靶基因敲除区域上游的同源序列, 而GENE_down1和GENE_down2都是靶基因敲除区域下游的同源序列. 为了实现筛选标签基因KmURA3的循环使用, 在设计时, GENE_down1和GENE_down2需要是同源序列, 这样才可以实现在5-FOA反向筛选时能通过二次内源性同源重组实现筛选标签基因KmURA3的掉落. 另外, 为了提高第一次同源重组的效率和准确性, GENE_down2可以在GENE_down1同源区域下游延长50～200bp. 除此之外, 需要尽可能确保GENE_down1、GENE_down2和靶基因同源区域起始序列是一致的, 这样最终敲除区域的位置就和该起始序列位置一致.

本研究中, 通过这种方法构建的Kmhis3Δ、Kmura3Δhis3Δ、Kmura3Δade2Δ、Kmura3Δhis3Δade2Δ、Kmhis3Δade2Δ等5株营养基因缺陷型宿主菌可作为K.marxianus分子遗传学研究和遗传工程应用研究的实验材料. 同时, 本研究所建立的K.marxianus无残留多基因敲除方法不仅可以用于K.marxianus多基因靶向敲除, 也可用于外源基因在K.marxianus基因组上的靶向整合.

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A New Method for Genomic Non-Trace Molecular Manipulation Suitable forKluyveromycesmarxianus

GUO Chao1, 2, CHEN Yongyi1, 2, ZHOU Jungang1, 2, YU Yao1, 2, LÜ Hong1, 2

(1. State Key Laboratory of Genetic Engineering, School of Life Sciences, Fudan University, Shanghai 200438, China；2.ShanghaiEngineeringResearchCenterofIndustrialMicroorganisms,Shanghai200438,China)

Kluyveromycesmarxianusbelongs to the genusKluyveromycesof the family Saccharomycetaceae, which has great potential for industrial application, with its traits including high secretory capacity, faster growth rate, the capacity to utilize a wide range of substrates, thermotolerance, etc. So a suitable technology for the genetic engineering onKluyveromycesmarxianusis necessary. WithKmura3Δ as the original strain, this paper proposed a new method suitable forKluyveromycesmarxianusto construct non-trace multiple gene disruption mutant strain via homologous recombination withKmURA3 as selective marker which can be reused. In this study, this method was successfully used to construct five nutritional gene-deficient host strains：Kmhis3Δ,Kmura3Δhis3Δ,Kmura3Δade2Δ,Kmura3Δhis3Δade2Δ, andKmhis3Δade2Δ. These mutant strains can be used for further research on the industrial application and molecular genetics ofKluyveromycesmarxianus.

Kluyveromycesmarxianus; multiple gene knockout;KmURA3;KmHIS3;KmADE2

0427-7104(2016)05-0576-11

2016-03-21

国家高新技术研究发展计划(2014AA021301, 2013AA102803B, 2012AA021501)；上海科委基地建设项目(13DZ2252000)

郭 超(1990—),男,硕士研究生;吕 红,女,教授,通讯联系人,E-mail：honglv@fudan.edu.cn.

Q 93-31

A