番茄DNA复制因子RFC1在减数分裂重组中的功能研究

刘 静，王 英，王宏宽，倪迪安，马 红，王应祥

(1. 复旦大学 生命科学学院 植物科学研究所，上海 200433； 2. 上海应用技术学院生态技术与工程学院，上海 201418)



番茄DNA复制因子RFC1在减数分裂重组中的功能研究

刘 静1，#，王 英1，#，王宏宽1，倪迪安2，马 红1，王应祥1

(1. 复旦大学 生命科学学院 植物科学研究所，上海 200433； 2. 上海应用技术学院生态技术与工程学院，上海 201418)

减数分裂是真核生物有性生殖所必需，前期研究表明拟南芥DNA复制因子RFC1在减数分裂重组中具有重要作用，但其同源基因在其他物种中的减数分裂或其他功能还未有报道.为了检验番茄RFC1在减数分裂中的功能，我们建立了减数分裂特异RFC1RNAi转基因番茄，发现其花粉活性显著降低，而且减数分裂异常.利用DAPI染色观察染色体形态，发现RFC1RNAi减数分裂细胞在终变期和中期Ⅰ形成多价体，表明重组异常.DNA双链断裂指示蛋白γH2AX在RFC1RNAi粗线期染色体上分布的保留滞后，进一步支持RFC1RNAi中的重组异常.拟南芥和番茄分别属于真双子叶植物中的两个不同大支，蔷薇类和菊类，因此本文的结果也表明DNA合成基因RFC1在进化距离很远的不同植物物种中的功能相对保守.

减数分裂； DNA复制因子； 番茄； 减数分裂特异性RNA干扰

减数分裂(meiosis)是有性生殖生物产生生殖细胞时，进行的染色体数目减半的细胞分裂活动，包括减数分裂 Ⅰ 和减数分裂 Ⅱ.减数分裂 Ⅱ 类似于有丝分裂，而减数分裂 Ⅰ 是减数分裂特异的方面，涉及到同源染色体之间的相互作用，包括配对、联会、重组和分离[1-2].相对于其他几个事件，重组是减数分裂过程中同源染色体相互作用中研究相对较多的.重组不仅保证了同源染色体之间的物理连接，对同源染色体后期的正确分离起到重要作用，还导致了父母染色体之间产生不同等位基因的新组合，从而大大提高了后代的遗传多样性.

减数分裂重组包括DNA的双链断裂、加工、合成和连接.迄今为止，以模式植物拟南芥为材料，运用正向和反向遗传学方法已经克隆并分析了近90个具有减数分裂重要功能的基因[2]，但是DNA合成环节的基因还鲜有报道.通过对拟南芥雄性减数分裂细胞进行转录组测序，发现减数分裂细胞表达一批DNA复制相关的基因[1，3].已有的研究表明，减数分裂重组中的DNA合成类似于有丝分裂的DNA复制，其过程高度保守[4-5].酵母有丝分裂DNA复制主要需要3种DNA聚合酶(Polα、Polε和Polδ)和3个相关复制因子(RFC、RPA和PCNA)[4].其中Polε主要负责前导链的合成；Polα则和Primase主要在后滞链启动时负责合成短RNA-DNA片段，然后Polδ完成这些片段的延伸，形成Okazaki片段.最后再经过进一步对这些片段加工、切割和连接完成DNA复制.减数分裂重组中的DNA合成被假设是通过类似的过程而实现的，但相关基因功能的研究则较少.通过遗传筛选酵母中减数分裂重组有缺陷的突变体，鉴定到一个Polδ缺失C末端4个氨基酸的特异突变体，该突变体有丝分裂正常，只影响了减数分裂重组[6].拟南芥和水稻中的RPA1也参与了减数分裂重组[7-8].最近的研究表明拟南芥POL2A(酵母Polε的同源基因)和RFC1都是减数分裂重组主要通路所必需[9-10].综上所述，DNA复制相关基因在减数分裂重组中具有功能，但是这些基因在其他物种减数分裂中的功能还未有报道.

被子植物中约3/4为真双子叶植物，而真双子叶植物中最大的两个分支是蔷薇类和菊类.拟南芥是属于蔷薇类的十字花科成员；为了检验同源基因在进化上与拟南芥距离较远的植物中的功能，本研究以菊类的茄科成员番茄(Solanumlycopersicum)为材料，采用减数分裂特异的基因沉默技术，分析番茄DNA复制因子RFC1在减数分裂中的功能.

1 材料和方法

1.1 材料

大肠杆菌EscherichiacoliDH5α，根瘤农杆菌AgrobacteriumtumefaciensGV3101和pMeioDMC1载体(将35S启动子由SlDMC1的启动子替换后构建的RNAi载体)均为本实验室保存；国内栽培种“黄顶红”番茄由上海应用技术学院提供；PCR引物合成和测序由生工生物工程上海(股份)有限公司提供；植物总RNA提取试剂盒购于QIAGEN公司；PCR产物回收试剂盒、DNA片段割胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购于AXYGEN公司；高保真酶购于东洋纺公司；限制性内切酶，T4DNA连接酶，聚核苷酸激酶和SYBR试剂购于TaKaRa公司；胰蛋白胨，酵母提取物，牛肉提取物等购于Sigma公司；染色液4′，6-二脒基-2-苯基吲哚(4′，6-diamidino-2-phenylindole， DAPI)购于Vector Laboratories；ZYP1和γH2AX抗体见文献[9-10].

植物培养土配方：黑土40%，蛭石40%，珍珠岩20%；植物1/2MS培养基配方：MS粉2.2g/L，蔗糖10g/L，KOH调pH至5.8，加0.7%琼脂粉，灭菌条件121℃，15min，降温到约60℃时加抗生素25μg/mL；大肠杆菌LB培养基：胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，氯化钠10g/L，固体培养基加15g/L 琼脂粉，灭菌条件121℃，15min，降温到约60℃时倒板，选择培养基含100μg/mL氨苄青霉素或50μg/mL 卡那霉素；农杆菌YEB培养基配方：牛肉提取物5g/L，酵母提取物1g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，MgSO42mol/L，KOH调pH至7.4，选择培养基含25μg/mL利福平，50μg/mL卡那霉素.

1.2 方法

1.2.1 系统发生树构建

使用MEAG 5中的muscle序列比对软件对蛋白序列进行序列比对.接着使用FastTree软件的极大似然(Maximum Likelihood)方法对比对好的序列构建进化树，参数使用默认.进化树构建好之后，使用MEGA 5打开和调整.

1.2.2 番茄RFC1干涉载体的构建和转基因植物的获取

设计减数分裂特异基因DMC1启动子的番茄扩增引物(表1)，用番茄DMC1基因的启动子替代RNAi载体上的35S启动子[9-10].选取番茄RFC1基因cDNA保守区域，获得插入有番茄RFC1基因cDNA片段的pMeioDMC1质粒.番茄转基因植物采用农杆菌介导的子叶节转化方法获得[11].

1.2.3 番茄RNA提取及实时荧光定量PCR分析

用植物总RNA提取试剂盒分别提取野生型番茄和转基因番茄的叶片和不同时期花药总RNA，在检测完总RNA的完整性、纯度和浓度后，按照Promega反转录试剂盒方法获得番茄的cDNA.之后，使用ABI实时荧光定量PCR仪器做荧光定量PCR分析，将获得的番茄cDNA样品每个重复3次，相对表达水平通过2-ΔΔCT方法分析[12]，使用标准方差计算3次重复的波动性，使用的内参为番茄EF1-alpha基因.另外实验过程使用的引物是按照番茄RFC1基因的cDNA序列设计的前后两对引物，内参引物按照番茄EF1-alpha基因的cDNA序列保守区域设计的，引物序列见表1.

表1 基因水平检测引物

1.2.4 花粉活性的亚历山大红染色观察

剪取番茄的花序，在室温条件下用卡诺固定液(V冰醋酸∶V无水乙醇=1∶3)固定过夜[13].在解剖镜下，用解剖针将花序中已经开裂的花剥去，留取花药发黄且尚未开裂的花苞.将其浸入含有亚历山大红染液的离心管内[13]，在室温下染色4h.用解剖针将花药剖开，除去杂质后加入少量的亚历山大红染液，盖上盖玻片，轻轻用指尖压片后，在白光下镜检拍照.用指甲油封玻片(-20℃预冷).

1.2.5 展片法观察花粉母细胞减数分裂染色体形态

实验采用的展片法主要参考文献[13]，稍作改动如下：剪取番茄的花序，在室温条件下用卡诺固定液固定过夜.在解剖镜下，用解剖针将花序中已经开裂的花和发黄的花药去掉，将剩余的花序用酶解液(0.3% cellulase+0.3% pectinase+0.5% cytohelicase)在37℃下酶解30min.用镊子将花苞从酶解液中取出，用0.01mol/L柠檬酸缓冲液清洗花苞3次，将盛有花苞的离心管放入冰盒里.将离心管内的花苞用镊子取出，解剖针将番茄的6个花药剖出后，除去杂质，用尖头镊子夹碎花药，从而将花粉母细胞释放到水中.将载玻片置于45℃的热台上，待载玻片上只剩下一层水膜时，在水膜区滴加20 μL 60%冰醋酸，并使得减数分裂期细胞在载玻片上分布均匀.等待30s后，在溶液的正上方用移液器滴加100μL卡诺固定液(-20℃预冷)，在热台上等待载玻片上液体晾干.每张载玻片用移液枪头滴加1滴DAPI染色液，盖上盖玻片，避光染色10min后，在显微镜下观察并拍照.

1.2.6 卡宝品红染色观察四分体

剪取番茄花序，在室温下用卡诺固定液固定过夜.将番茄花序用双蒸水冲洗2～3次后，剥去含黄色花药的花，取番茄花序最外围的1～2个花苞到载玻片上.在解剖镜下用解剖针剥出花药后，除去杂质，向载玻片上滴加10μL双蒸水，用解剖针的针尖将花粉母细胞从药室中挤出，并涂布在载玻片上.自然风干载玻片后，用20μL移液枪头向载玻片滴加一滴卡宝品红溶液(原液A：3g碱性品红溶于100mL 70%酒精中；原液B：取原液A 10mL加入到90mL 5%石炭酸水溶液中；原液C：取原液B 55mL，加入6mL冰醋酸和6mL 福尔马林：38%的甲醛.取C液10～20mL加45%冰醋酸80～90mL，再加山梨醇1.8g，配成10%～20%浓度的石炭酸品红液).染色2～3min后，加上盖玻片，在显微镜下观察并拍照.

1.2.7 免疫荧光

实验采用的展片法主要参考文献[13]，稍作改动如下：取处于减数分裂时期的番茄花序于加有1mL 2%多聚甲醛的离心管中，在-0.1MPa，室温固定15min，当观察花序完全沉到管底后，用0.01mol/L柠檬酸缓冲液将固定好的花序清洗3次，每次3min.然后除去带发黄花药的花，将一个处于减数分裂时期的番茄花药转移到载玻片上，滴加10μL双蒸水于花药上.用解剖针的针尖将花粉母细胞从药室中挤出，除去杂质后，用尖头镊子将剩余混合物质夹碎，盖上盖玻片，玻棒轻轻敲打盖玻片.将敲打后的玻片放入液氮中冷冻1min，取出玻片用双面刀片迅速将盖玻片挑开，自然风干.将载玻片分别用以下溶液处理：Wash buffer Ⅰ溶液(由1×PBS+1% Triton X-100配置成，在室温条件下浸泡60min)、Block buffer(由1×PBS+5% BSA+0.1% Tween20+1mmol/L EDTA配置成，在37℃条件下孵育30min)、一抗(Block buffer稀释一抗后，每张载玻片滴加200μL后用封口膜封片，4℃过夜，其中ZYP1稀释比例为1∶200，H2Ax稀释比例为1∶100)、Wash buffer Ⅱ(由1×PBS+0.1% Tween20配置成，在室温下清洗3次，每次15min)、Block buffer(在室温下孵育60min)、二抗(Block buffer稀释二抗后，每张载玻片滴加200μL后用封口膜封片，在37℃下孵育60min，二抗稀释比例为1∶400)、Wash buffer Ⅱ(在室温下清洗3次，每次15min).用吸水纸吸干多余的水，在每张载玻片上滴加1滴DAPI染色液，避光染色10min，在显微镜(Zeiss Axio Imager A2)下观察并拍照.

2 结果与分析

2.1 RFC1的生物信息学分析

为了分析番茄RFC1基因在进化过程中的保守性，使用MEGA v5.0软件的ML方法，构建了不同物种RFC1的进化树(图1，见第626页).从中可以看出，除了经过近期基因组重复的物种(如大豆Glycinemax，猴面花Mimulus； 高粱Sorghum)，大多数物种中RFC1为单拷贝基因，暗示了RFC1基因功能比较保守.其中番茄与拟南芥RFC1基因都属于真双子叶植物，而代表单子叶植物的禾本科则比较远.这个模式表明RFC1基因在真核生物的进化历史中基本保持单拷贝，暗示其功能是高度保守的.序列比对表明番茄和拟南芥RFC1氨基酸序列一致性和相似性分别为62%和74%.运用MUSCLE v3.6软件对选取不同物种的RFC1蛋白序列比对分析，发现植物中RFC1蛋白都具有BRCT结构域(BRCA1 C Terminus(BRCT) domain)、ATPase结构域和RFC结构域(图2，见第626页).BRCT结构域在植物体内可解除DNA分子交联，推测具有内切酶活性[14]；ATPase结构域是超基因家族含有的ATPase单元[15]，在细胞内途径中的蛋白重构中起作用，通过水解ATP从而改变分子构象；而RFC结构域在体内对RFC1的功能很重要[16].此外，RFC1蛋白的C端有一个相对保守区域，拟南芥中研究表明该结构域可能与其在减数分裂中的功能有关[9].

2.2 番茄RFC1在花药不同发育时期的表达模式分析

基因的表达模式和功能有一定的相关性，为了研究SlRFC1的功能，本研究首先分析了SlRFC1的表达模式.提取野生型番茄六期早期花药、六期花药、七期花药和叶子4个组织RNA，在番茄RFC1基因前端和末端设计引物，利用定量PCR的方法检测RFC1在不同组织内的表达量.如图3所示，SlRFC1基因在检测的4个组织中均有表达，表明该基因可能是一个组成型表达的基因，与拟南芥中的报道相似[9].此外，SlRFC1在花药中表达明显高于叶子中的表达量，且在第六期的花药中表达最高，该时期花药中包含正在进行减数分裂的花粉母细胞.

2.3 番茄RFC1RNAi载体的构建和转基因植株获得

小鼠和植物中的研究表明RFC1是一个有丝分裂周期必需的基因，功能缺失突变致死[4，9，17-18]，在拟南芥中有研究利用弱突变体和减数分裂特异的基因沉默技术分析了RFC1在减数分裂重组中的重要功能[9].拟南芥中采用的是编码减数分裂特异重组酶DMC1基因的启动子，该基因在真核生物中相对保守[19]，本研究克隆了番茄的DMC1基因的启动子，并构建了含RFC1的RNAi载体.利用农杆菌侵染番茄愈伤组织方法，将该载体转入番茄并获得阳性转基因植株.并利用定量PCR技术分析了RFC1在阳性植株RFC1RNAi-1、RFC1RNAi-2和RFC1RNAi-3花药中的表达量.如图4所示，在检测的3个不同发育时期的花药中，SlRFC1基因在3个不同的转基因株系中的表达量显著低于对照(P<0.01).说明转基因阳性植株中目的基因的表达量确实得到降低.

2.4 番茄RFC1RNAi阳性植株的形态表型分析

本研究选择了两个代表性的RFC1RNAi-1和RFC1RNAi-3株系进行了详细分析.观察RFC1RNAi阳性番茄的营养生长，发现RFC1RNAi-1和RFC1RNAi-3植株的营养生长与野生型类似(图5(a)，见第628页)，具有健康的叶子、茎和旺盛的长势，与拟南芥中的结果类似[9].这说明RFC1RNAi转基因并没有影响到体细胞中的DNA复制和其他过程，同时也暗示番茄的DMC1基因可能也是减数分裂细胞特异表达的基因.为了进一步研究RFC1RNAi植株的育性是否正常，运用亚历山大红染色检测了对照和转基因植物的花粉活性.如图5(b)所示，野生型花粉粒大小均匀，均能染成红色，表明花粉均有活力.相对之下，RFC1RNAi-1和RFC1RNAi-3只有少量的花粉可以染成红色，大部分染成蓝色，表明只有少量有活力的花粉(图5(b)).为了进一步调查花粉育性下降的原因，本实验首先运用卡宝品红溶液染色减数分裂的直接产物四分体，发现野生型中能够观察到4个均匀的小孢子(图5(c))，而转基因植株中观察到有多分体(多于4个小孢子)现象，且产生了极小的异常小孢子(图5(c))，表明转基因植物中的减数分裂过程存在异常.

2.5 番茄RFC1RNAi植株花粉母细胞的减数分裂染色体形态观察

为了研究RFC1RNAi植株减数分裂在哪个时期出现异常，本实验通过染色体展片并用DAPI染色观察减数分裂过程中的染色体形态.如图6所示，野生型和RFC1RNAi植株的染色体形态从细线期到双线期观察不到明显的异常.终变期野生型番茄中可以形成12个二价体，而RFC1RNAi植株中不能形成典型的二价体，有多于两条染色体相互缠绕的现象(图6(a))，该表型类似于拟南芥rfc1突变体中观察到的多价体[9].中期Ⅰ时，野生型番茄中二价体在纺锤体的牵引下，并列排列在细胞的赤道板上(图6(b))；而在RFC1RNAi减数分裂细胞中，部分染色体看似正常二价体，在纺锤体的牵引下排列在赤道板上(图6(b))，但是其他染色体为多价体，则不能很好地排列在赤道板上，彼此间相互牵连；另外，RFC1RNAi减数分裂细胞中有单价体现象.这些结果表明番茄RFC1是正常同源二价体形成所必需.

2.6 番茄RFC1RNAi-3植株中联会复合体中央元件ZYP1定位分析

拟南芥的研究表明，rfc1-2突变体中联会局部异常，主要表现粗线期染色体局部观察不到联会中央元件ZYP1的信号[9].本研究运用ZYP1的抗体进行免疫荧光实验，结果显示野生型同源染色体在粗线期完全联会，ZYP1的信号与染色体的完全重合(图7).与野生型相比，RFC1RNAi-3植株该时期染色体上的ZYP1蛋白定位观察不到明显的异常(图7)，表明番茄RFC1的功能降低可能没有影响到同源染色体之间的联会.由于RFC1RNAi植物中仍有部分RFC1蛋白的存在，也许剩余RFC1仍能提供维护联会的功能.

2.7 番茄RFC1RNAi植株中γH2AX蛋白质的定位分析

番茄RFC1RNAi植株中多价体现象暗示着重组异常，拟南芥的研究表明RFC1突变影响了正常重组的修复进程[9，18].减数分裂重组起始于DNA双链的断裂(Double Strand Break， DSB)[20]，磷酸化的组蛋白变体γH2AX可以用来指示断裂的DSB[21]，而且该蛋白高度保守，不同植物间的同源蛋白具有相通的抗原性.本实验室前期研究制备了可以检验拟南芥γH2AX的多克隆抗体.本实验利用免疫荧光技术观察了γH2AX蛋白质在野生型和RFC1RNAi-3植株染色体上的分布情况.已有的研究表明，DSB一般在细线期或偶线期过渡时期形成，粗线期基本完全修复.如图8(见第630页)所示，偶线期时，野生型和RFC1RNAi-3中该蛋白的定位没有显著差异，说明RFC1RNAi-3中能够形成正常的DSB，暗示了重组没有受到明显影响.粗线期时，由于DSB基本完全修复，野生型中γH2AX信号显著降低(图8)，而RFC1RNAi-3植株γH2AX信号继续存在，其降低明显滞后，暗示DSB的修复进程延迟了.

3 讨 论

RFC1基因在多数真核生物中为单拷贝，序列也高度保守，但它在绝大部分物种中的功能还没有被研究过.因为其在有丝分裂DNA复制中具有重要功能.酵母、植物和动物中，RFC复合体的亚基突变，经常会导致有丝分裂时期的细胞死亡，阻碍了研究这些基因在减数分裂中的功能[4，9，17-18，22].前期通过寻找弱突变材料，并结合减数分裂特异的基因沉默技术，在拟南芥中研究了RFC1和另外一个DNA聚合酶POL2A在减数分裂重组中的重要功能[9，15，20].番茄是茄科植物，和十字花科的拟南芥分别属于真双子叶两个最大的分支，因此，分析RFC1在番茄减数分裂中的功能可以拓展对其功能保守性的认识.本研究利用和拟南芥一样的减数分裂特异基因沉默技术，分析了番茄RFC1同源基因在减数分裂的功能.结果表明降低RFC1的表达，会影响植物的育性、产生多价体，及延迟了DSB的修复等，与拟南芥中rfc1突变体的表型相似，说明番茄和拟南芥RFC1基因在减数分裂中的功能相对保守.

但是，拟南芥中的研究表明突变体在粗线期有局部不能联会的现象，其原因可能是由于有些干涉敏感性的交换途径形成受阻.番茄中的ZYP1免疫荧光结果没有看到类似的情况，其原因其一可能是该转基因植物还保留了部分RFC1功能，定量PCR结果也证明转基因植物中仍然有少量RFC1的转录.另外一个原因可能是番茄和拟南芥在本身染色体结构上有差异.番茄的减数分裂研究很少，目前存在很多疑问；比如，还不清楚番茄减数分裂细胞一次能够形成多少个DSB，有多少个DSB最终形成了交换，番茄和拟南芥联会的机制是否有异同等.最近研究表明，与拟南芥相比，模式单子叶植物水稻有其特异的联会复合体元件，有些元件的功能有分化，如水稻的联会复合体中央元件ZEP1的突变反而增加重组频率[23].总之，本研究首次分析了番茄RFC1基因在减数分裂中的重要功能，进而表明该基因的功能在进化距离较远的不同物种中依然非常保守.

致谢: 感谢福建农林大学张亮生教授在进化树构建上给予的帮助.

[1] 陈晓亚，薛红卫.植物生理与分子生物学 [M].4版.北京：高等教育出版社，2012：87-104.

[2] WANG Y， CHENG Z， MA H. Meiosis：Interactions between homologous chromosomes [M]. New York， USA：Springer， 2014：1-34.

[3] YANG H， LU P， WANG Y，etal. The transcriptome landscape ofArabidopsismale meiocytes from high-throughput sequencing：The complexity and evolution of the meiotic process [J].PlantJ， 2011，65(4)：503-516.

[4] BELL S P， DUTTA A. DNA replication in eukaryotic cells [J].AnnuReviewBiochemistry， 2002，71(1)：333-374.

[5] STRICH R. Meiotic DNA replication [J].CurrentTopicsinDevelopmentalBiology， 2004，61(4)：29-60.

[6] MALOISEL L， BHARGAVA J， ROEDER G S. A role for DNA polymerase delta in gene conversion and crossing over during meiosis inSaccharomycescerevisiae[J].Genetics， 2004，167(3)：1133-1142.

[7] OSMAN K， SANCHEZ-MORAN E， MANN S C，etal. Replication protein A(AtRPA1a) is required for class I crossover formation but is dispensable for meiotic DNA break repair [J].TheEMBOJ， 2009，28(4)：394-404.

[8] CHANG Y， GONG L， YUAN W，etal. Replication protein A(RPA1a) is required for meiotic and somatic DNA repair but is dispensable for DNA replication and homologous recombination in rice [J].PlantPhysiology， 2009，151(4)：2162-2173.

[9] WANG Y， CHENG Z， HUANG J，etal. The DNA replication factor RFC1 is required for interference-sensitive meiotic crossovers inArabidopsisthaliana[J].PLoSGenetics， 2012，8(11)：e1003039.

[10] HUANG J， CHENG Z， WANG C，etal. Formation of interference-sensitive meiotic cross-overs requires sufficient DNA leading-strand elongation [J].ProcNatlAcadSciUSA， 2015，112(40)：12534-12539.

[11] MAUD A W H， DANNETTE V C W， CHRISTINE A N，etal. Production of transgenic soybean plants usingAgrobacterium-mediated DNA transfer [J].NatureBiotechnology， 1988，6：915-922.

[12] KENNETH J L， THOMAS D S. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCTmethod [J].Methods， 2001，25(4)：402-408.

[13] WANG Y， CHENG Z， LU P，etal. Molecular cell biology of male meiotic chromosomes and isolation of male meiocytes inArabidopsisthaliana[J].MethodsinMolecularBiology， 2014，1110：217-230.

[14] CHONG J P， BLOW J J. DNA replication licensing factor [J].ProgressinCellCycleResearch， 1996，2：83-90.

[15] ELLISION V， STILLMAN B. Reconstitution of recombinant human replication factor C(RFC) and identification of an RFC subcomplex possessing DNA-dependent ATPase activity [J].TheJournalofBiologicalChemistry， 1998，273(10)：5979-5987.

[16] KIM J， ROBERTSON K， MYLONAS K J，etal. Contrasting effects of Elg1-RFC and Ctf18-RFC inactivation in the absence of fully functional RFC in fission yeast [J].NucleicAcidsResearch， 2005，33(13)：4078-4089.

[17] LIU Q， WANG J， MIKI D，etal. DNA replication factor C1 mediates genomic stability and transcriptional gene silencing inArabidopsis[J].ThePlantCell， 2010，22(7)：2336-2352.

[18] LIU Y， DENG Y， LI G，etal. Replication factor C1(RFC1) is required for double-strand break repair during meiotic homologous recombination inArabidopsis[J].PlantJ， 2013，73(1)：154-165.

[19] DOUTRIAUX M P， COUTEAU F， BERGOUNIOUX C，etal. Isolation and characterisation of the RAD51 and DMC1 homologs fromArabidopsisthaliana[J].Molecular&GeneralGenetics，1998，257(3)：283-291.

[20] SZOSTAK J W， ORR-WEAVER T L， ROTHSTEIN R J，etal. The double-strand-break repair model for recombination [J].Cell， 1983，33(1)：25-35.

[21] LOWNDES N F， TOH G W. DNA repair：The importance of phosphorylating histone H2AX [J].CurrentBiology， 2005，15(3)：R99-R102.

[22] MCALEAR M A， TUFFO K M， HOLM C. The large subunit of replication factor C(Rfc1p/Cdc44p) is required for DNA replication and DNA repair inSaccharomycescerevisiae[J].Genetics， 1996，142(1)：65-78.

[23] WANG M， WANG K， TANG D，etal. The central element protein ZEP1 of the synaptonemal complex regulates the number of crossovers during meiosis in rice [J].ThePlantcell， 2010，22(2)：417-430.Functional Analysis of the Tomato DNA Replication Factor RFC1 in Meiotic Recombination

LIU Jing1，#， WANG Ying1，#， WANG Hongkuan1， NI’Di’an2， MA Hong1， WANG Yingxiang1

(1. Institute of Plant Biology， School of Life Sciences， Fudan University， Shanghai 200438， China；2.TheEcologicalTechniqueandEngineeringCollege，ShanghaiInstituteofTechnology，Shanghai201418，China)

Meiosis is essential for eukaryotic sexual reproduction. Previous study showed thatArabidopsisRFC1 is required for normal meiotic recombination， but the role of its homologs in other species has not been reported. To study the tomato RFC1 homologue in meiosis， theinvivofunction ofSlRFC1 was investigated by silencing theSlRFC1 gene using a meiosis-specific DMC1 promoter in transgenic RFC1RNAiplants. Phenotypic analysis found that RFC1RNAiplants have obviously reduce pollen viability and fertility， and are abnormal in meiosis. Comparison of chromosome morphology of WT and RFC1RNAimeiocytes using chromosome spread with DAPI staining showed that， unlike wild type diakinesis and metaphaseⅠmeiocytes with 12 bivalents(pairs of associated homologous chromosomes)， the RFC1RNAimeiocytes formed multivalents at similar stages， indicating non-homologous association. Immunolocalization of DNA double stranded break(DSB) marker γH2AX showed persistent signals in RFC1RNAipachytene chromosomes compared with WT， providing further evidence for abnormal recombination in RFC1RNAi. In conclusion， this is the first time that the tomato DNA replication factor RFC1 is shown to be required for meiotic recombination， using meiosis-specific gene silencing. SinceArabidopsisand tomato belong to two difference clades of Rosids and Asterids among eudicots， respectively， our results also reveal the RFC1 function in meiotic recombination is conserved in meiosis among evolutionarily different angiosperm species.

meiosis； DNA replication factor；Solanumlycopersicum； meiotic specific RNAi

0427-7104(2016)05-0623-09

2016-01-30

国家自然科学基金面上项目(31570314)；荷兰Rijk Zwaan种业公司项目

刘 静(1989—)，女，硕士研究生；#：同等贡献；王应祥，男，研究员，通讯联系人，E-mail：yx_wang@fudan.edu.cn.

Q 5

A