益气温阳活血方对慢性心力衰竭心室重塑大鼠β3-肾上腺素能受体、血清Ⅰ型前胶原羧基端肽和Ⅲ型前胶原氨基端肽的影响

杨冬花 顾广富 罗建华

(贵州省人民医院干医科，贵州 贵阳 550002)



益气温阳活血方对慢性心力衰竭心室重塑大鼠β3-肾上腺素能受体、血清Ⅰ型前胶原羧基端肽和Ⅲ型前胶原氨基端肽的影响

杨冬花 顾广富1罗建华

(贵州省人民医院干医科，贵州 贵阳 550002)

目的 探讨益气温阳活血方对慢性心力衰竭心室重塑大鼠β3-肾上腺素能受体(β3-AR)、血清Ⅰ型前胶原羧基端肽(PⅠCP) 和Ⅲ型前胶原氨基端肽(PⅢNP)的影响。方法 通过异丙肾上腺素(ISO)诱导慢性心力衰竭动物模型。计算左、右心室心肌的心脏指数(LVMI、 RVMI)，应用酶联免疫吸附(ELISA)法检测血清PⅠCP和PⅢNP含量，以逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法以及Western印迹法检测β3-AR mRNA及蛋白质表达水平。结果 与正常组比较，模型组LVMI 〔(2.987±0.318 vs 2.350±0.468)mg/g〕、血清PⅠCP〔(16.357±3.650 vs 12.843±3.124)pg/ml〕、PⅢNP〔(64.984±17.477 vs 21.245±5.354)pg/ml〕含量及β3-AR mRNA(0.888±0.064 vs 0.743±0.086)与蛋白质(4.413±0.729 vs 2.312±0.394)的表达水平明显升高(均P<0.05)；益气温阳活血方能够明显降低慢性心力衰竭大鼠LVMI，减少PⅠCP和PⅢNP含量，抑制β3-AR mRNA与蛋白质表达水平的升高，与正常组比较〔(2.557±0.379 vs 2.350±0.468)mg/g〕、血清PⅠCP〔(13.111±2.758 vs 12.843±3.124)pg/ml〕和PⅢNP〔(25.967±9.659 vs 21.245±5.354)pg/ml〕含量及β3-AR mRNA(0.781±0.067 vs 0.743±0.086)与蛋白质(2.484±0.642 vs 2.312±0.394)，均无显著性差异(P>0.05)。结论 益气温阳活血方可能通过抑制β3-AR的表达减少PⅠCP和PⅢNP含量逆转心室重塑，改善心脏功能。

慢性心力衰竭；心室重塑；β3-肾上腺素能受体； PICP；PⅢNP；益气温阳活血方

心室重塑和神经激素-细胞因子之间的恶性循环是心力衰竭发生发展的基本机制，是导致心力衰竭不断进展的病理生理学基础〔1〕。β3-肾上腺素能受体(β3-AR)是新近发现的β肾上腺受体(β-AR)，在心力衰竭晚期可产生持续的负性肌力作用，导致心肌抑制，加重心力衰竭〔2〕。既往研究发现，益气温阳活血方在心力衰竭早期可通过过氧化物酶体增殖物活化物受体(PPAR)γ信号通路调节血管紧张素Ⅱ、醛固酮的表达，防止心室重塑，改善心脏功能〔3〕，但是否能通过抑制心力衰竭持续高表达的β3-AR水平防止心室重塑，目前尚不清楚。本研究通过观察益气温阳活血方对慢性心衰心室重塑大鼠β3-AR表达水平的影响研究，为进一步临床运用提供理论依据和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康Wistar雄性大鼠40只，清洁级，鼠龄5～6个月，体重(250±10)g，由贵阳医学院实验动物学部提供，合格证号：SYSK(黔)2002-0001。

1.2 益气温阳活血方主要成分 人参、黄芪、丹参、益母草各30 g，白术、茯苓各15 g，桂枝9 g等11味中药。药材从贵州省人民医院中药房一次性选购，生药按比例取好，加水浸泡1 h，第一遍煮沸40 min，滤渣取汁；再加水煮沸15 min，滤渣取汁，合并2次煎液，在水浴中浓缩至每毫升煎液含生药4 g，保存备用。

1.3 试剂与仪器 异丙肾上腺素(Sigma公司)，卡维地洛(齐鲁制药有限公司，批号：H20000100)，Trizol(Invitrogen公司)， Rnasin(Promega公司)，M-MLV(Promega公司)，引物由上海生物工程公司合成，大鼠抗-β3-AR抗体(Abcam公司)，ECL显影试剂盒(Santa Cruz 公司)，Ⅰ型前胶原羧基端肽(PⅠCP)和Ⅲ型前胶原氨基端肽(PCⅢNP)检测试剂盒(上海信裕生物科技有限公司)，制胶、电泳及转膜仪(Bio-Rad公司)，PCR仪(Eppendorf 公司)，酶标仪(Bio-Rad公司)。

1.4 方法

1.4.1 心力衰竭的模型制备〔4〕及分组 采用异丙肾上腺素腹腔注射(3 mg·kg-1·d-1)诱导慢性心力衰竭模型。选用Wistar雄性大鼠，随机分组为正常组，模型组，中药组(益气温阳活血方治疗组)，西药组(卡维地洛治疗组)，每组10只，模型组、中药组及西药组根据上述方法制备慢性心力衰竭动物模型。造模后第1天中药组及西药组即分别给予益气温阳活血方(8 ml/kg)和卡维地洛(50 mg/kg)灌胃治疗，2次/d，正常组及模型组则以蒸馏水等量灌胃，共治疗8 w。

1.4.2 左、右心室心肌的心脏指数(LVMI、RVMI) 试验结束后，开胸取出心脏，灌洗后分别称取左心室、右心室湿质量。以左心室湿质量/体质量和右心室湿质量/体质量，分别代表LVMI、RVMI，可反映心室重塑情况。

1.4.3 血清PⅠCP和PⅢNP检测 4组动物相应时间处死后，采集颈动脉血分离血清，以ELISA法检测上述指标，操作过程参照试剂盒说明进行。

1.4.4 心肌组织β3-AR mRNA的表达 β3-AR (444 bp)上游5′-AGTGGGACTCCTCGTAATG-3′，下游5′-CGCTTAGCTAC GACGAAC-3′。GAPDH (187 bp):上游5′-GACAACGGCTCCGGCATGTG-3′，下游5′-TGAGGATGCCTCTCTTGC-3′。按Trizol试剂说明书提取左室心肌组织总RNA，参照第一链cDNA合成试剂盒说明书进行逆转录反应，然后进行PCR反应。取PCR产物5 μl进行琼脂糖凝胶电泳、照相，利用UVP凝胶扫描仪测定条带的吸光度(A)值，以目的基因与GAPDH条带的吸光度(A)值的比值代表其表达的相对量。

1.4.5 心肌组织β3-AR蛋白质的表达 提取左心室组织蛋白质，制备聚丙烯酰胺凝胶、蛋白电泳、转膜。一抗浓度均为1∶1 000，二抗浓度为1∶2 000，化学发光试剂法曝光、显影和定影，凝胶成像分析系统进行密度扫描并分析。

1.5 统计学方法 采用SPSS11.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 大鼠心室重塑指标、血清PⅠCP和PⅢNP含量的变化 模型组大鼠LVMI、血清PⅠCP和PⅢNP含量与正常组、中药组、西药组比较均明显升高(P<0.05)。中药组、西药组大鼠LVMI、血清PⅠCP和PⅢNP含量与正常组比较，无显著差异(P>0.05)。中药组大鼠LVMI、血清PⅠCP和PⅢNP含量与西药组比较，无显著差异(P>0.05)。见表1。

表1 各组心室重塑指标、血清PⅠCP和PⅢNP含量、β3-AR mRNA和蛋白质表达量的比较

与正常组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05

1：分子量标准；2：正常组；3：模型组；4：中药组；5：西药组图1 β3-AR mRNA的表达

1：正常组；2：模型组；3：中药组；4：西药组图2 β3-AR 蛋白质的表达

2.2 各组心肌组织β3-AR mRNA及蛋白质的表达水平 图1，图2可见，模型组大鼠心肌组织β3-AR mRNA及蛋白质的表达水平与正常组、中药组、西药组比较均明显升高(均P<0.05)。中药组、西药组心肌组织β3-AR mRNA及蛋白质的表达水平与正常组比较，无显著差异(均P>0.05)。中药组心肌组织β3-AR mRNA及蛋白质的表达水平与西药组比较，无显著差异(均P>0.05)。

3 讨 论

β-AR是一类膜表面糖蛋白，可识别并与儿茶酚胺特异性结合，激活胞内信号转导，从而产生一系列生理生化反应〔5〕。根据各亚型对特异性配体的亲和性、生物学效应、基因结构和信号转导机制，β-AR主要分为β1-AR、β2-AR、和β3-AR〔6〕。β1-AR激动后可增强心肌收缩力，但持续活化可引起心肌肥厚、间质纤维化和心肌细胞凋亡等心室重塑慢性效应〔7〕，β2-AR则不但具有抗凋亡的作用，还轻度增加心肌收缩力，对心脏具有保护作用〔8〕。Gauthier等〔9〕首先发现人类心室肌组织存在介导负性变力效应的β3 -AR。β3-AR介导负性肌力作用，在心力衰竭早期，β3-AR上调可保护心脏免于高水平儿茶酚胺所致的心脏损伤，但当心力衰竭进展到终末阶段时，持续激活的β3-AR的负性变力效应可抑制心肌收缩，导致心功能恶化〔2〕，在大鼠终末期衰竭心脏，β3-AR激动剂可明显恶化心功能并可诱导心肌细胞凋亡〔10〕。同时还能通过β3-AR信号通路级联放大效应，通过相关信号转导通路进而活化多种心肌肥大相关基因，如肿瘤坏死因子α、内皮素-1、血管紧张素Ⅱ等的表达促进心室重塑〔11〕。

心肌细胞外间质的主要成分是胶原纤维，其中以Ⅰ型与Ⅲ型胶原为主，心室重塑时，心肌总胶原含量增加，或者Ⅰ/Ⅲ型胶原比例增加将导致心肌僵硬度增加、 心肌舒张功能受损〔12〕。PⅠCP和PⅢNP是在特殊肽链内切酶的作用下脱离前胶原以游离形式被释放入血的肽段，其释放与胶原纤维的生成是1∶1的关系，所以两者随着胶原合成增多其释放增加，它们被认为是体内Ⅰ、Ⅲ型胶原合成的间接标志，可作为反映心脏胶原重塑的指标〔13〕。

目前心力衰竭的治疗目标不仅是要改善患者的症状、提高生活质量，更重要的是修复衰竭心肌的生物学性质，阻断神经内分泌、细胞因子的激活和心室重塑之间的恶性循环〔14〕。慢性心力衰竭的治疗通过阻断β受体策略不断得到大规模临床实验的印证，β受体阻滞剂防止心室重塑已经成为心力衰竭治疗的基石。卡维地洛是一种具有多种附加作用的第三代β受体阻滞药，是非选择性地阻滞β受体及选择性地阻滞α1受体，对心力衰竭具有明显的治疗效果和良好的安全性，卡维地洛已被美国FDA批准为治疗心力衰竭的首选β受体阻滞剂。研究发现，异丙肾上腺素灌流离体大鼠心脏，心衰组用卡维地洛后心功能指标明显改善，与特异性的β3-AR抑制剂SR59230A作用于离体大鼠心脏后心功能指标的变化差异无统计学意义〔15〕；而且卡维地洛还能使大鼠衰竭心室β3-AR mRNA表达明显降低、减轻心室重塑〔16〕。从而可以推断卡维地洛可通过阻断β3-AR发挥治疗心力衰竭的作用。

益气温阳活血方是一组针对心力衰竭病机所组成的临床有效方剂，方中主要成分人参、黄芪、丹参、益母草、白术、茯苓、桂枝等11味中药，具有益气温阳、活血利水之功效。本研究结果显示，益气温阳活血方与卡维地洛一样，可以改善心力衰竭大鼠心脏功能，减轻左心室湿质量/体质量的比值，同时还能抑制β3-AR mRNA和蛋白质的表达，减少血清PⅠCP和PⅢNP的含量，防止心室重塑。初步可以推论，益气温阳活血方通过阻断心力衰竭时过分激活的β3-AR，减少血清PⅠCP和PⅢNP血清含量，抑制胶原产生，逆转心室重塑，从而改善心脏的收缩和舒张功能，具体作用机制有待于进一步研究证实。

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〔2015-04-11修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

贵州省社会公关项目(黔科合SY字〔2011〕3055)；贵州省科技联合基金(黔科合SY〔2010〕3121号)

1 贵阳中医学院2012级研究生

杨冬花(1971-)，女，主任医师，医学博士，主要从事心力衰竭的临床与基础研究。

R286

A

1005-9202(2016)19-4678-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.19.003