黄芪甲苷对急性脑出血大鼠神经功能的影响

谢 靖， 高惠春， 郑 玺

(1石河子大学医学院第一附属医院神经内科， 新疆 石河子 832008； 2阜康市人民医院神经科， 新疆 阜康 831500； 3解放军第四七四医院神经科， 新疆 乌鲁木齐 830000)



黄芪甲苷对急性脑出血大鼠神经功能的影响

谢 靖1△， 高惠春2， 郑 玺3

(1石河子大学医学院第一附属医院神经内科， 新疆 石河子 832008；2阜康市人民医院神经科， 新疆 阜康 831500；3解放军第四七四医院神经科， 新疆 乌鲁木齐 830000)

目的： 研究黄芪甲苷对急性脑出血大鼠神经功能的影响，以及神经元特异性烯醇化酶(NSE)、Notch1和NF-κB蛋白表达的变化。方法: 注入自体动脉血建立实验性急性脑出血大鼠模型，实验分为假手术组、模型组、低剂量治疗组和高剂量治疗组；对各组大鼠进行神经功能缺损评分，并考察脑系数及脑含水量； ELISA检测血清中NSE水平；Western blot 法检测Notch1和NF-κB表达变化。结果: 黄芪甲苷能够减轻急性脑出血大鼠神经功能缺损症状，显著降低脑系数以及脑含水量，抑制急性脑出血大鼠血清中NSE水平以及Notch1和NF-κB蛋白的表达(P<0．05)。结论: 黄芪甲苷具有减轻急性脑出血大鼠神经功能缺损的作用，可能通过抑制急性脑出血大鼠血清中NSE水平以及脑组织中Notch1和NF-κB蛋白表达，从而发挥其神经保护作用。

急性脑出血； 神经元特异性烯醇化酶； Notch1； NF-κB

急性脑出血(acute cerebral hemorrhage, ACH)主要指原发性非外伤性脑实质内出血，是急性脑血管病中最严重的一类疾病。中国急性脑出血疾病的发病率逐步提高，占急性脑血管病的20%～30%，病死率高达43%～51%，发病后患者一年内的存活率约为38%[1]。

黄芪甲苷(astragaloside IV, AST)是中药黄芪的主要有效成分之一，已有研究证明黄芪甲苷主要具有免疫调节、降血糖、降血脂、抗炎、抗病毒等作用。报道指出黄芪甲苷在病毒性心肌炎中具有抗心肌细胞凋亡的作用，同时，通过抗自由基及抑制细胞凋亡而对局灶性缺血的脑组织具有保护作用[2-3]。韩金利等[4]研究发现黄芪甲苷通过上调脑出血灶周围组织的Bcl-2蛋白表达，并抑制Bax与caspase-3蛋白表达，抑制细胞凋亡，从而对出血的脑组织具有保护作用。黄芪甲苷可能通过上调ZO-1蛋白表达而抑制脑缺血再灌注后血脑屏障通透性的增高[5]。此外，黄芪甲苷通过减少炎症物质的作用从而减轻血脑屏障的损伤[6]，可改善脑血管通透性，从而减轻炎症、脑水肿与脑缺血等症状。本研究通过建立实验性急性脑出血大鼠模型，探讨黄芪甲苷对急性脑出血大鼠神经功能缺损的作用，并初步探讨其相关机制。

材 料 和 方 法

1 材料

健康Wistar大鼠40只，雌雄各半，体重(300±20) g，10～12周龄，由南京医科大学实验动物中心提供，自由饮食，饲养环境的室温为(22±2) ℃。

黄芪甲苷购自上海纯优生物科技有限公司，纯度大于98%；神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)ELISA试剂盒购自ADL；抗Notch1抗体和NF-κB抗体购自天津赛尔生物技术有限公司。

2 方法

2.1 急性脑出血大鼠模型的建立 参照吕田明等[7]的方法建立大鼠急性脑出血模型，具体方法为采用10%水合氯醛腹腔注射(0.4 mL/100 g)，成功麻醉后，俯卧固定于脑立体定位仪上，水平针穿破耳鼓膜，固定门齿与门齿沟，切开头部中央皮肤，暴露颅骨与前囱，以前囱为0点，前囱后0.2 cm，中线右侧3 mm处用微型电钻钻直径为1 mm的孔，用微量注射器吸取大鼠自体尾动脉血，以20 μL/min速度缓缓推进脑组织，注入血量为50 μL，进针深度为6 mm，留针30 min后拔出，用磷酸锌黏固剂封闭，缝合，局部碘酒消毒。

2.2 实验分组与样本采集 采用随机的方法将40只大鼠随机分为4组：假手术组(sham组)，建模步骤同模型组，但不注入尾静脉血；模型组(即ACH组)，给予相同剂量的生理盐水灌胃，每天灌胃1次，共给药21 d；低、高剂量AST治疗组(AST-L组、AST-H组)在造模成功后分别给予黄芪甲苷100 mg/kg与200 mg/kg，每天灌胃1次，共给药21 d。分别于给药1 d、4 d、7 d、14 d、21 d时尾静脉取血，4 000 r/min离心4 min，分离血清，置于-80 ℃冰箱中备用；给药完成后，用10%水合氯醛过量麻醉，断头取脑，分离出脑内血肿部位，液氮中保存。

2.3 神经功能评分方法(neurological deficit score, NDS) 参照Longa等[8]的方法对模型进行评分，共分为5级：无神经功能缺损，正常活动为0分；瘫痪侧前肢不能充分伸展为1分；大鼠有向瘫痪侧侧旋的行为为2分；向瘫痪侧倾倒为3分；无法自发行走，存在意识障碍为4分；观察大鼠麻醉清醒后的形态，进行神经功能评分，每天1次。

2.4 脑系数与脑水肿的测定 快速断头取脑后，称量全脑重量，计算脑系数(%)=全脑重量/体重×100%；按冠状面切开脑组织，分为左前、左后、右前和右后4个部分，滤纸吸干表面水分，称量左后和右后两部分湿重，置于95 ℃烘箱4 d，烘干至恒重，计算脑组织含水量(%)=(湿重-干重)×100%。

2.5 免疫酶联测定血清中NSE的含量 按照试剂盒说明书进行操作，依次将相应的100 μL标准品加入酶标版的空白微孔，编号，再分别加入100 μL样品血清至空白微孔；各孔分别加入50 μL的酶标记液，37 ℃孵育1 h，清洗，每孔加入底物A、 B液各50 μL，避光反应15 min，加入50 μL终止液终止反应，于酶标仪450 nm处读取吸光度(A)值。

2.6 Western blot实验 取各组大鼠血肿组织，加入蛋白裂解液，蛋白定量后，调整蛋白量。取适量裂解产物，上样后进行SDS-PAGE。完成电泳后，将蛋白转移至PVDF膜，加入5%的脱脂奶粉的TBST溶液，室温放置1 h，TBST快洗1次，加入相应 I 抗孵育，4 ℃过夜，TBST液洗涤3次，加入相对应的 II 抗室温孵育45 min，TBST液洗涤3次，加入ECL化学发光液孵育3 min，暗盒曝光，显影冲洗，测定蛋白条带的积分吸光度。

3 统计学处理

运用SPSS 16.0统计软件分析，所有实验数据结果采用均数±标准差(mean±SD)表示，各组间差异采用单因素方差(one-way ANOVA)进行分析，采用Bonferroni校正的t检验分析两两数据间的差异，以P<0．05表示差异具有统计学意义。

结 果

1 神经功能缺损评分

假手术组的大鼠麻醉清醒后能正常活动；模型组的大鼠大多数向瘫痪侧倾倒，个别出现无法自发行走，并随时间推移而症状加重；低剂量治疗组的大鼠刚开始出现向瘫痪侧倾倒，向瘫痪侧侧旋，随时间推移，症状减轻；高剂量治疗组的大鼠刚开始出现向瘫痪侧侧旋的症状，随时间推移症状减轻。与假手术组相比，模型组和治疗组的NDS评分均显著上升(P<0．05)，提示造模成功；与模型组相比，治疗组大鼠的神经功能缺损程度显著减轻，且高剂量组减轻程度较大，见表1。

表1 各组大鼠脑出血神经功能缺损评分表

*P<0．05vssham group;#P<0．05vsACH group.

2 黄芪甲苷对急性脑出血大鼠脑水肿形成的影响

如表2所示，与假手术组相比，模型组大鼠的脑系数和脑含水量均显著增加(P<0.05)；与模型组相比，黄芪甲肝对急性脑出血大鼠脑系数和脑含水量均显著下降(P<0.05)，以高剂量疗效较好。

3 黄芪甲苷对血清中NSE水平变化的影响

与假手术组相比，模型组的NSE水平显著升高(P<0.05)，在4 d时达到最大值；与模型组相比，低、高剂量治疗组的NSE水平均显著下降(P<0.05)，其中高剂量治疗组下降程度较大，见表3。

表2 各组大鼠脑系数和脑含水量的变化

Table 2.The changes of brain coefficient and water content (%.Mean±SD.n=10)

GroupBraincoefficientBrainwatercontentSham0．34±0．0272．19±3．04ACH0．56±0．04∗76．47±1．43∗AST⁃L0．41±0．03#73．14±1．08#AST⁃H0．37±0．02#72．38±1．27#

*P<0．05vssham group;#P<0．05vsACH group.

表3 大鼠血清中NSE水平的变化

*P<0．05vssham group;#P<0．05vsACH group.

4 各组大鼠血肿脑组织中Notch1蛋白表达的变化

如图1所示，与假手术组相比，模型组大鼠血肿脑组织中Notch1的蛋白表达显著上升(P<0．05)；与模型组相比，低、高剂量治疗组大鼠血肿脑组织中Notch1的蛋白表达显著下降(P<0．05)，高剂量治疗组降低幅度更大。

5 各组大鼠血肿脑组织中NF-κB蛋白表达的变化

与假手术组相比，模型组大鼠血肿脑组织中NF-κB的蛋白表达显著上升(P<0．05)；与模型组相比，低、高剂量治疗组大鼠血肿脑组织中NF-κB的蛋白表达显著下降(P<0．05)，高剂量治疗组降低幅度更大，见图2。

讨 论

NSE主要存在于中枢神经系统，作为糖酵解途径的一种关键生物酶，以脑组织中含量最多，常作为脑出血所致神经损伤的标志物。当脑组织损伤时，细胞膜被破坏，释放NSE进入脑脊液或通过血脑屏障进入外周血[9]。有报道指出脑出血后急性期患者血清NSE显著增高，常在2～5 d时出现最大值[10]；脑出血量越大，NSE水平升高越显著[11]。脑出血急性期血清中NSE含量的峰值与血肿大小和神经功能缺损评分呈正相关[12]。本实验中发现黄芪甲苷能够显著改善急性脑出血大鼠神经功能缺损的程度，降低脑系数和脑含水量，并降低急性脑出血大鼠血清中的NSE，提示黄芪甲苷具有保护神经功能的作用。

Figure 1.The expression of Notch1 in hematoma tissue of each group. Mean±SD.n=3.*P<0．05vssham group;#P<0．05vsACH group.

图1 各组大鼠血肿组织中Notch1的蛋白表达变化

Figure 2.The expression of NF-κB in hematoma tissue of each group. Mean±SD.n=3.*P<0．05vssham group;#P<0．05vsACH group.

图2 各组大鼠血肿组织中NF-κB的蛋白表达变化

Notch信号通路和NF-κB与脑损伤后的炎症反应有关。Notch在缺血性脑损伤部位激活后，引起淋巴细胞的增殖和细胞因子的分泌，进而促进免疫炎性反应[13]。研究表明Notch在脑缺血性损伤时的表达异常上升，增加炎症反应并促进神经细胞凋亡[14]。NF-κB是一种可以启动免疫和炎症反应相关的转录因子，在脑出血的血肿周围区表达显著增加，Notch信号通路通过调控NF-κB的表达来调节缺血后炎症基因的表达[15]。研究发现，脑出血发生后，NF-κB开始活化，并在1～3 d内达到峰值[16]。本实验中发现黄芪甲苷对脑组织神经具有保护作用，可能与Notch1和NF-κB的表达有关，

本研究通过观察黄芪甲苷对实验性急性脑出血大鼠模型的影响，发现黄芪甲苷具有抑制脑出血大鼠神经功能缺损的作用，可能通过调节Notch1和NF-κB蛋白表达，从而发挥保护脑神经组织的作用。

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(责任编辑： 陈妙玲， 罗 森)

Effect of astragaloside IV on neurological function in acute cerebral he-morrhage rats

XIE Jing1, GAO Hui-chun2, ZHENG Xi3

(1DepartmentofNeurology,FirstAffiliatedHospitalofMedicalCollege,ShiheziUniversity,Shihezi832008,China;2DepartmentofNeurology,FukangPeople’sHospital,Fukang831500,China;3DepartmentofNeurology,No. 474HospitalofPLA,Wulumuqi830000,China.E-mail:xiejing19788@163.com)

AIM: To investigate the effect of astragaloside IV on neurological function and the protein expression of neuron-specific enolase (NSE), Notch1 and NF-κB in acute cerebral hemorrhage (ACH) rats.METHODS: ACH model in rats was established via injection of autologous blood, and the rats were divided into 4 groups: sham, ACH, ACH+astragaloside IV (100 mg/kg) and ACH+astragaloside IV (200 mg/kg) groups. The impairment of neurological function in each group was graded, and the brain coefficient and water content were calculated. The serum level of NSE was measured by ELISA. Additionally, the expression of Notch1 and NF-κB was determined by Western blot. RESULTS: Astragaloside IV improved the neurological function and decreased the brain coefficient and water content in ACH rats. Moreover, the ACH-induced increase in NSE was inhibited after astragaloside IV treatment. Similarly, astragaloside IV also significantly attenuated the expression of Notch1 and NF-κB in ACH rats.CONCLUSION: Astragaloside IV attenuates the impairment of neurological function in ACH rats, which may be through decreasing the NSE level and down-regulating the expression of Notch1 and NF-κB.

Acute cerebral hemorrhage; Neuron-specific enolase; Notch1; NF-κB

1000- 4718(2016)10- 1905- 04

2016- 04- 12

2016- 07- 25

△通讯作者 Tel: 0993-2858492； E-mail： xiejing19788@163.com

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.028

杂志网址： http://www.cjpp.net