miR-203在舌癌组织中的表达及其对Tca8113细胞活力和侵袭的影响*

郑 红， 张文玲， 林 波， 张赛男， 刘瑞敏， 薛 鹏△

(河南大学 1医学院病理生理学教研室， 2淮河临床学院口腔科， 3医学院免疫学教研室，河南 开封 475004)



miR-203在舌癌组织中的表达及其对Tca8113细胞活力和侵袭的影响*

郑 红1△， 张文玲2， 林 波1， 张赛男3， 刘瑞敏3， 薛 鹏3△

(河南大学1医学院病理生理学教研室，2淮河临床学院口腔科，3医学院免疫学教研室，河南 开封 475004)

目的： 研究舌癌组织中miR-203的表达，分析它与临床病理学参数之间的相关性，并探讨其与人舌癌Tca8113细胞活力及侵袭能力的关系。方法: 收集28例舌癌手术标本，每例标本分别取癌灶及远端5 cm处正常黏膜组织(即远癌正常组织)2个部分。实时定量 PCR检测舌癌患者肿瘤组织中 miR-203的相对表达水平，分析其与临床病理特征之间的关系；脂质体2000介导 miR-203 mimic和无关序列对照转染Tca8113细胞株，并通过CCK-8实验和Transwell小室侵袭实验检测上调miR-203 对Tca8113细胞活力及侵袭能力的影响。结果: 28例舌癌组织中 miR-203 表达水平与癌旁正常组织相比显著降低(P<0.05)，miR-203的表达与肿瘤TNM分期及淋巴结转移存在相关性(P<0.05)，而与患者的年龄和性别无关。Tca8113细胞转染miR-203 mimics 上调miR-203表达可显著抑制Tca8113细胞株的活力及侵袭能力，与对照组比较差异有统计学显著性(P<0.05)。 结论: 上调miR-203表达能有效抑制舌癌细胞的生长和侵袭，miR-203可能成为舌癌基因治疗的靶点。

miR-203； 舌癌； 细胞活力； 细胞侵袭

舌鳞状细胞癌是头颈部常见的恶性肿瘤，发病率居口腔癌的首位，因早期易发生局部浸润和淋巴转移的特点，预后较差，确诊后五年生存率小于50%[1]。因此，研究舌癌的发病机制对于发现新的治疗药物和策略具有重要的意义。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一种由19到24个核苷酸组成的非编码单链基因表达调节物， miRNAs通过结合靶基因mRNA的3’末端在转录后翻译水平发挥作用，参与细胞增殖、分化、凋亡、衰老等各种生理病理过程。自从上世纪九十年代调控线虫发育的miRNA——lin-4和let-7的发现[2-3]， miRNAs在肿瘤生物学领域获得了广泛关注，这是因为miRNAs在恶性肿瘤中普遍失调，参与多种肿瘤的发生发展。近年来研究表明，miRNAs在肿瘤的发生中既可作为致癌基因又可作为抑癌基因发挥作用，参与肿瘤细胞的发生、浸润、转移，诱导肿瘤细胞凋亡或者肿瘤微血管的形成[4-6]。

作为miRNAs家族中的一个成员，miR-203被发现在多种肿瘤中表达失调[7-8]，但在舌癌组织中的表达及其作用机制的研究少见报道。本文拟通过对28例舌鳞状细胞癌中miR-203的检测，分析它们与临床病理学参数之间的相关性，探讨其与舌癌发生发展的关系。

材 料 和 方 法

1 研究对象及一般资料

28例舌癌组织标本为2014年10月至2015年6月收集河南大学附属淮河医院和河南省肿瘤医院舌癌手术标本，其中男15例，女13例；年龄在39～72(56.4±3.7)岁之间。所有患者术前均无化疗、放疗及免疫治疗史。标本均在离体30 min内迅速取材，分别取部分癌灶及癌旁正常黏膜组织, 液氮中保存，待后续real-time PCR检测用。病理组织学证实28例舌癌均为鳞癌。该研究经过河南大学伦理委员会批准。

2 材料

2.1 细胞株 人舌癌细胞株Tca8113购自中科院上海细胞所。

2.2 引物 根据GenBank中miR-203序列，采用Oligo 6.0软件设计引物(详见表1)，由上海生物工程公司合成，PAGE纯化。

表1 Real-time PCR引物

2.3 主要试剂 LipofectamineTM2000转染试剂盒 购于 Invitrogen； RNA 提取试剂盒购于 QIAGEN；dNTP、RNasin和AMV购于 Promega；real-time PCR 试剂盒购于TaKaRa；miR-203 模拟物(miR-203 mimics)和 miR-203 模拟物无关序列对照(scramble)购自Gene Pharma；CCK-8试剂盒为碧云天生物技术公司产品；Transwell培养板为Coining Costar产品；Matrigel购自BD。

3 方法

3.1 miR-203表达水平的检测 RNA的提取参照Qiagen小量RNA提取试剂盒操作说明进行。逆转录和荧光定量PCR 采用嵌合荧光检测法，根据real-time PCR 试剂盒(TaKaRa)与扩增仪(ABI5700)说明，用质粒同时扩增，制作标准曲线，记录各管扩增Ct值。miR-203以U6作为内参照, 记录Ct值，每个样本的Ct值取平均数，相对表达量以2-ΔΔCt表示，ΔΔCt=[Ct(癌组织miR-203)-Ct(癌组织U6)]-[Ct(癌旁正常组织miR-203)-Ct(癌旁正常组织U6)]。

3.2 细胞的培养和转染 Tca8113细胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液常规培养至对数生长期，转种1×106(每孔)到6孔培养板，置37 ℃、5% CO2培箱内培养24 h，待细胞融合度约为50%～70% 时进行转染。实验分为 miR-203 模拟物转染组 (Tca8113-miR-203 mimics组)、模拟物阴性对照组(Tca8113-scramble组)和空白对照组(Tca8113-control组)。使用 Lipofectamine 2000在6孔培养板内进行转染，按照说明书的步骤进行细胞转染。

3.3 CCK-8实验检测细胞活力 将处于对数生长期的Tca8113-miR-203 mimics、Tca8113-scramble和Tca8113-control细胞用0.25%的胰酶消化、清洗、吹打后，调整细胞浓度，按每孔1.0×103的密度将细胞接种于96孔培养板上，每孔加含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培养液0.1 mL, 每日换液1次，每6孔为1组，分别于接种后24 h、48 h、72 h依次将各组每孔加入CCK-8试剂10 μL，置37 ℃、5% CO2培养箱内孵育4 h，在酶联免疫检测仪上测定各孔的吸光度(A)值。取6孔平均值描绘细胞生长曲线。

3.4 细胞侵袭能力的检测 实验按照Boyden chamber assay 说明书进行。孔径8 μm的聚碳酯膜置于Boyden chamber小室的上下室之间Transwell板上；稀释后的Matrigel加入Boyden chamber上室中，覆盖整个聚碳酯膜，聚合成胶；Transwell培养板下室加入用无血清培养基培养的3组Tca8113细胞上清200 μL作为趋化因子；400 μL 1×109/L细胞悬浮液加入到上室，5% CO2、37 ℃条件下培养24 h；取出上室，用冰预冷的甲醇固定30 min，苏木素染色 1 min；梯度乙醇脱水，二甲苯透明；切取聚碳酯膜，置于载玻片用树脂封片；在高倍镜下随机计数6个视野的细胞数，取平均值。

4 统计学处理

利用SPSS 17.0软件进行统计学分析。采用t检验和单因素方差分析比较组间的差异，相关性检验用Spearman相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 Real-time PCR结果

与对应癌旁正常组织相比，舌癌组织中miR-203表达明显降低, 差异有统计学显著性(P<0.05)。结合临床病理学参数分析，舌癌 miR-203的表达与TNM分期及淋巴结转移有关，而与患者的年龄和性别无关,见图1、表2。

Figure 1.The relative fold change of miR-203 in tongue squamous carcinoma tissues compared with adjacent normal tissues.*P<0.05vsnormal.

图1 舌癌组织中miR-203表达量较癌旁正常组织的相对倍数变化

表2 按临床病理学参数分组观察舌癌组织中miR-203相对表达量的差异

Table 2.The relative expression of miR-203 in tongue carcinoma tissues and the relationship with clinicopathological parameters in 28 tongue cancer cases (Mean±SD)

ParameternmiR⁃203PGenderMale170．260±0．0140．615Female110．269±0．123Age(year)<60130．363±0．0380．517≥60150．354±0．202TNMstageⅠandⅡ160．402±0．1350．001Ⅲ120．245±0．032LymphnodeNegative110．328±0．4210．007metastasisPositive170．205±0．057

Tca8113-miR-203 mimics组、Tca8113-scramble组和Tca8113-control组细胞接种于6孔培养板(每组均设6个复孔)，培养24 h后，提取RNA，荧光定量PCR检测出3组细胞miR-203相对表达量。Tca8113-miR-203 mimics组细胞miR-203表达明显增强，而Tca8113-scramble组细胞与空白对照组细胞相比，miR-203表达差异无统计学显著性，见表3。

2 上调miR-203的表达对舌癌细胞活力的影响

测定处于对数生长期的Tca8113-miR-203 mimics、Tca8113-scramble和Tca8113-control细胞0、24、48和72 h的A值，描绘细胞生长曲线。结果显示Tca8113-miR-203-mimics细胞组在24 h、48 h和72 h测定的A值均明显小于空白组及模拟物阴性对照组细胞(P<0.05)，说明上调miR-203的表达可显著抑制舌癌细胞的活力,见图2。

Figure 2.The effect of miR-203 mimics on the proliferation of tongue cancer cell line Tca8113.

图2 上调miR-203表达对舌癌细胞株Tca8113细胞活力的影响

3 上调miR-203的表达对舌癌细胞侵袭能力的影响

Transwell小室细胞侵袭实验结果提示，与模拟物阴性对照组和空白组细胞相比，转染miR-203 mimics的Tca8113细胞侵袭和穿透 Matrigel的能力明显减弱, 差异有统计学显著性(P<0.05),说明上调miR-203能导致舌癌细胞的侵袭能力降低，见图3、表3。

Figure 3.The effect of miR-203 overexpression on the invasion ability of tongue cancer cell line Tca8113. A: Tca8113-miR-203 mimics; B: Tca8113-scramble; C: Tca8113-control.

图3 miR-203过表达对舌癌细胞株Tca8113侵袭能力的影响

讨 论

miR-203是miRNAs大家族的重要一员，定位于14q32.33，14号染色体上有一个约7 Mb大小的易丢失区，该区域是染色体上的不稳定区域，目前发现包含miR-203在内约12%的miRNA存在于该区域[9]。miR-203特异表达于上皮组织中，并且在不同组织来源的恶性肿瘤中表达水平存在明显差异，可作为癌基因亦可作为抑癌基因，与其靶基因共同作用参与肿瘤细胞的增殖分化、侵袭转移和凋亡等[7-8, 10-12]。

表3 各组细胞中miR-203的相对含量和Matrigel侵袭实验结果

Table 3.The expression of miR-203 detected by real-time PCR and the result of Matrigel invasion assay in each group (Mean±SD.n=6)

TreatmentRelativeexpressionofmiR⁃203CellnumberTca8113⁃miR⁃203mimics1．164±0．007∗∗24．6±8．1∗Tca8113⁃scramble0．265±0．01649．7±7．9Tca8113⁃control0．258±0．04253．2±4．5

*P<0.05,**P<0.01vsTca8113-control.

研究发现miR-203在食管癌[10]、非小细胞肺癌[11]、肝癌[12]、骨肉瘤[13-14]等肿瘤中的表达明显下调。食管鳞状细胞癌 (esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)[10]中，miR-203表达与细胞增殖能力呈负相关。在对骨肉瘤的研究中，Liu等[13]发现miR-203表达下调，上调miR-203表达可通过负调控TBK1基因，降低细胞的体外生长，抑制体内致瘤性。Yang等[14]有类似的发现，miR-203通过下调靶基因RAB22A抑制骨肉瘤细胞的增殖和转移。还有研究报道miR-203在肺小细胞癌中表达降低，通过靶向负调控Bmi1基因，影响肿瘤细胞的增殖[15]。

恶性肿瘤的转移和侵袭与胚胎时期上皮-间质转化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)过程相似，EMT可激活因子ZEB1，通过抑制miR-203的表达抑制肿瘤细胞分化[16]。Zhao等[17]利用慢病毒载体转染卵巢癌SKOV3和OVCAR3细胞，发现上调miR-203表达，抑制了癌细胞的转移侵袭和EMT过程。Obayashi等[18]近期发现miR-203通过反向调控NUAK1基因表达，从而抑制头颈部高侵袭性鳞癌细胞系的浸润转移和上皮-间质转化。

我们通过real-time PCR检测28例舌癌组织标本中miR-203的表达，舌癌组织中 miR-203 表达水平与癌旁正常组织相比显著降低，miR-203的表达与肿瘤TNM分期及淋巴结转移存在相关性，发现miR-203在淋巴结转移患者肿瘤组织中的表达明显低于无淋巴结转移者，TNMⅢ期的肿瘤中miR-203表达水平显著低于TNMⅠ和Ⅱ期，提示miR-203表达降低预示预后不良， miR-203可能与舌癌的侵袭转移相关。我们对体外生长的舌癌Tca8113细胞株进行miR-203模拟物的转染，促进舌癌细胞miR-203的高表达，用无关序列转染的Tca8113细胞和未转染的Tca8113细胞作为对照，进行细胞生长曲线的描记和Transwell小室细胞侵袭实验，过表达miR-203后Tca8113细胞株的生长和侵袭能力受到明显抑制。

综上所述，miR-203在舌癌的发生发展过程中可能发挥重要作用， miR-203有望成为舌癌诊断和进展的分子标志物。但miRNA对靶基因的调控是个复杂的网络，一种miRNA可以调控多基因的表达，成熟的miRNAs可能源于各种基因组结构域中的前体序列，表明miRNAs可以单独作用于高度复杂的基因调节，而一个基因的表达也可以同时被多个miRNA影响[4]。因此，我们还需进一步深入探讨miR-203的作用机制，为舌癌的生物学防治提供新的思路和靶点。

[1] 戴红良，葛树卿，楚明会，等. 染料木黄酮通过抑制VEGF表达抑制人口腔癌TCA8113细胞增殖[J]. 中国病理生理杂志，2016, 32(3):464-469.

[2] Lee RC, Feinbaum RL, Ambros V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14[J]. Cell, 1993, 75(5): 843-854.

[3] Reinhart BJ, Slack FJ, Basson M. The 21-nucleotide let-7 RNA regulates developmental timing inCaenorhabditiselegans[J]. Nature, 2000, 403(6772): 901-906.

[4] Garzon R, Marcucci G, Croce CM. Targeting microRNAs in cancer: rationale, strategies and challenges[J]. Nat Rev Drug Discov, 2010, 9(10):775-789.

[5] 唐夏莉， 焦德敏， 陈 君， 等. miRNA-126对肺癌A549细胞的增殖、迁移、侵袭及EGFR/AKT/mTOR信号通路的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2016, 32(3):458-463.

[6] 车玉传， 苏运钦， 温旺荣， 等. miR-155-5p在宫颈癌血清中的表达及其对宫颈癌细胞的影响[J]. 中国病理生理杂志, 2013, 29(12):2193-2200.

[7] Zhao G, Guo Y, Chen Z, et al. miR-203 functions as a tumor suppressor by inhibiting epithelial to mesenchymal transition in ovarian cancer[J].J Cancer Sci Ther, 2015, 7(2):34-43.

[8] Ren ZG, Dong SX, Han P, et al. miR-203 promotes proliferation, migration and invasion by degrading SIK1 in pancreatic cancer[J]. Oncol Rep, 2016, 35(3):1365-1374.

[9] Friedman RC, Farh KK, Burge CB, et al. Most mamma-lian mRNAs are conserved targets of microRNAs[J]. Genome Res, 2009, 19(1):92-105.

[10]Gu J, Wang Y, Wu X. MicroRNA in the pathogenesis and prognosis of esophageal cancer[J]. Curr Pharm Des, 2013, 19(7):1292-1300.[11]Tang R, Zhong T, Dang Y, et al. Association between downexpression of miR-203 and poor prognosis in non-small cell lung cancer patients[J]. Clin Transl Oncol, 2016, 18(4):360-368.

[12]Liu D, Wu J, Liu M, et al. Downregulation of miRNA-30c and miR-203a is associated with hepatitis C virus core protein-induced epithelial-mesenchymal transition in normal hepatocytes and hepatocellular carcinoma cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2015, 464(4):1215-1221.

[13]Liu S, Feng P. miR-203 determines poor outcome and suppresses tumor growth by targeting TBK1 in osteosarcoma[J]. Cell Physiol Biochem, 2015, 37(5):1956-1966.

[14]Yang D, Liu G, Wang K. miR-203 acts as a tumor suppressor gene in osteosarcoma by regulating RAB22A[J]. PLoS One, 2015, 10(9):e0132225.

[15]Chen T, Xu C, Chen J, et al. Micro RNA-203 inhibits cellular proliferation and invasion by targeting Bmi1 in non-small cell lung cancer[J]. Oncol Lett, 2015, 9(6):2639-2646.

[16]Wellner U, Schubert J, Burk UC, et al. The EMT-activator ZEB1 promotes tumorigenicity by repressing stemness-inhibiting microRNAs[J]. Nat Cell Biol, 2009, 11(12):1487-1495.

[17]Zhao GN, Guo YQ, Chen ZX, et al. miR-203 functions as a tumor suppressor by inhibiting epithelial to mesenchymal transition in ovarian cancer[J]. J Cancer Sci Ther, 2015, 7(2): 34-43.

[18]Obayashi M, Yoshida M, Tsunematsu T, et al. micro-RNA-203 suppresses invasion and epithelial-mesenchymal transition induction via targeting NUAK1 in head and neck cancer[J]. Oncotarget, 2016, 7(7):8223-8239.

(责任编辑： 林白霜， 罗 森)

Expression of miR-203 in human tongue carcinoma tissues and its in-fluence on viability and invasion ability of Tca8113 cells

ZHENG Hong1, ZHANG Wen-ling2, LIN Bo1, ZHANG Sai-nan3, LIU Rui-min3, XUE Peng3

(1DepartmentofPathophysiology,MedicalCollege,2DepartmentofStomatology,HuaiheClinicalCollege,3DepartmentofImmunology,MedicalCollege,HenanUniversity,Kaifeng475004,China.E-mail:zhenghong8916@163.com;xuepeng1978@googlemail.com)

AIM: To study the expression of miR-203 in tongue carcinoma tissues and the effect of miR-203 over-expression on the viability and invasion ability of Tca8113 cells.METHODS: Twenty-eight pairs of tongue carcinoma tissues and adjacent nontumor tissues were collected, and the clinicopathological characters were analyzed. miR-203 was detected in the tongue tissues of 28 patients with tongue carcinoma by real-time PCR. miR-203 mimics and scramble were transfected into Tca8113 cells by Lipofectamine 2000. The expression of miR-203 was detected in Tca8113, Tca8113-miR-203 mimics and Tca8113-scramble cells by RT-qPCR. The cell viability was measured by CCK-8 assay. The cell invasion ability was determined by Transwell chamber invasion experiment.RESULTS: miR-203 expression was significantly down-regulated in the tongue carcinoma tissues compared with those in the adjacent nontumor tissues. The expression of miR-203 was associated with TNM stage and lymph node metastasis. Up-regulation of miR-203 inhibited the viability and invasion ability of Tca8113 cells.CONCLUSION: miR-203 suppresses the growth and invasion of tongue carcinoma cells. miR-203 may be a potential therapeutic target for treating human tongue cancer.

miR-203; Tongue carcinoma; Cell viability; Cell invasion

1000- 4718(2016)10- 1896- 05

2016- 05- 30

2016- 08- 17

开封市科技发展计划项目(No. 1503112)；河南大学科研基金重点项目(No. 2010ZRZD02)

△通讯作者 郑 红 Tel: 0371-23880585; E-mail: zhenghong8916@163.com; 薛 鹏 Tel: 0371-23880398; E-mail: xuepeng1978@googlemail.com

R739.86； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.026

杂志网址： http://www.cjpp.net