Preparation and characteristic comparison of two phase-transition multifunctional nanoparticles

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(1.Department of Pharmacy, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing400016, China; 2.Institute of Ultrasound Imaging, Chongqing Medical University, Chongqing400010, China; 3.Chongqing Key Laboratory of Ultrasound and Engineering,Chongqing 400016, China; 4.Department of Obstetrics and Gynecology,Second Affiliated Hospital of Chongqing MedicalUniversity, Chongqing 400010, China)



·基础与实验研究·

Preparation and characteristic comparison of two phase-transition multifunctional nanoparticles

TANGQin1,2，3,ZHUShenyin1*,CHANGShufang4,CUIJianyu1,2,TIANZhonghua1,SUNJiangchuan4,WANGZhigang2,QIUFeng1

(1.DepartmentofPharmacy,FirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 2.InstituteofUltrasoundImaging,ChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China; 3.ChongqingKeyLaboratoryofUltrasoundandEngineering,Chongqing400016,China; 4.DepartmentofObstetricsandGynecology,SecondAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400010,China)

Objective To prepare two multifunctional nanoparticles loaded with indocyanine green (ICG) and liquid fluorocarbon (perfluoropentane [PFP] or perfluorohexane [PFH]), and compare their physicochemical properties, stability phase-transition and imaging capacity in vitro. Methods The PLGA nanoparticles loaded with ICG and PFP or PFH (IPNPs or IHNPs) were prepared using a modified double emulsion technique, and then the physicochemical properties, stability and phase-transition under heating, laser irradiation, LIFU exposure and photoacoustic imaging capacity were compared. Results There were no significant differences between the IPNPs and IHNPs about their physicochemical properties, including size ([490.53±36.96]nm vs [512.23±38.52]nm), zeta potential ([-14.40±1.40]mV vs [-13.97±1.61]mV) and absorption spectrum, and both of them were stable within 24 h. The phase-transition energy under different situations was significantly lower in IPNPs group compared with IHNPs. In addition, the ultrasonic and photoacoustic imaging capacity obviously increased in IPNPs. The cell viability was higher in IPNPs phase-transition irradiation with laser energy than that in IHNPs ([95.34±7.96]% vs [54.92±6.11]%,P<0.05). Conclusion IPNPs might be a more promising multifunctional platform for theranostics.

Multifunctional nanoparticles; Fluorocarbons; Phase-transition; Imaging

近年来，纳米医学技术的多功能化，可将显像诊断剂与治疗药物整合于同一给药系统，形成一种新的治疗诊断型多功能分子影像探针，实现医学成像引导下的可视化诊疗[1-4]，且随着该领域研究的深入，多功能造影剂可实现多模态成像，以弥补现有成像方式的不足。传统超声微泡造影剂为诊疗一体化的发展起到了巨大推动作用，但其粒径过大、不易穿过血管内皮间隙及不稳定等性质限制了其作为诊疗探针的应用与发展[3]。相变型高分子纳米粒的出现为诊疗一体化的发展提供了新的可能。目前常用的相变材料为液态氟碳化合物，其中以低沸点的液态全氟正戊烷(perfluoropentane, PFP)及全氟己烷(perfluorohexane, PFH)最为常用，沸点分别为29℃和56℃，在常温下均为液态，外界压力减小至气化压力阈值或温度升高至沸点以上时，可发生液气相转变，可用于超声、MRI等成像[5-6]。液态氟碳纳米粒可同时携载治疗药物，转运至治疗部位达到诊疗一体化的目的。吲哚菁绿(indocyanine green, ICG)是美国及我国食品药品监督管理局批准应用于临床的显像和诊断剂，其在近红外光区有最大光吸收，可作为良好的荧光探针实现对深部病变组织准确灵敏的显影。此外，ICG也作为光敏物质广泛应用于光动力疗法及光热疗法的研究[7-9]。

若将液态氟碳及ICG同时包载于乳酸-羟基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)carboxyl, PLGA)]中制备成纳米级微球，体外给予激光辐照，ICG吸收光能转变为热能，使液态氟碳发生相变，可实现多模态成像，同时产生活性氧和热效应发挥治疗作用，是一种非常有前景的多功能诊疗制剂。目前已有研究[5,10-12]报道了载ICG及PFH的PLGA纳米粒，可用于增强光声及超声显影，但缺乏载ICG及不同相变材料的相变型多功能纳米粒在理化性质、体外相变特性、光声及超声双模态成像等方面的比较研究。本研究拟通过制备IPNPs及IHNPs，体外比较二者的理化性质、稳定性、相变能力、光声及超声双模态成像情况，为纳米粒优化构建及应用提供依据。

1 材料与方法

1.1材料 ICG(Sigma)，PLGA(聚合比50∶50,济南岱罡生物工程有限公司)，PFP及PFH(Sigma)，聚乙烯醇(poly vinyl alcohol, PVA, Sigma)，Malvern粒径测定仪(Malvern)，Visual Sonics Vevo®LAZR光声成像系统，UV-Vis分光光度计(Thermo Scientific, 260-Bio)，Nd：YAG脉冲激光仪。

1.2 方法

1.2.1 IPNPs及IHNPs的制备 采用改良的双乳化法制备纳米粒[13-14]。将50 mg PLGA溶于2 ml二氯甲烷，0.5 mg ICG溶于超纯水中备用。取200l PFP或PFH加入ICG溶液中混合声振20 s；将声振后的乳浊液及0.5% PVA溶液加入到PLGA二氯甲烷溶液中声振2 min，得到一级乳化液；然后将5% PVA 水溶液加入到一级乳化液中再次混合声振2 min，得到二级乳化液；磁力搅拌4 h，使二氯甲烷充分挥发，离心洗涤至上清液澄清后重悬于超纯水中，4℃保存备用。全程冰浴并避光。不包裹ICG的PFP或PFH纳米粒(PNPs，HNPs)不加入ICG溶液，其余步骤同前。

1.2.2理化性质检测 用超纯水稀释IPNPs及IHNPs后，应用光学显微镜观察形态及分布，Malvern粒度测定仪检测粒径和电位；UV-Vis分光光度计检测ICG水溶液及PNPs、HNPs、IPNPs及IHNPs在 600～850 nm的吸收光谱。实验重复3次，取均值。

1.2.3纳米粒稳定性检测 将两种纳米粒用超纯水稀释后保存于37℃恒温水浴锅中，24 h后测定二者的粒径及电位，光学显微镜观察其形态。

1.2.4 相变及光声成像与超声成像观察 将相同浓度的IPNPs及IHNPs滴于载玻片，置于加热板中，光镜实时观察比较加热条件下各纳米粒的热致相变情况；532 nm激光器激发，光镜下观察比较各纳米粒的光致相变情况。将二者分别置于凝胶孔洞模型，用5 W低强度聚焦超声(low-intensity focused ultrasound， LIFU)辐照，观察并采集LIFU辐照前后超声造影模式图像；808 nm脉冲激光(20 Hz)辐照，光声成像系统采集光声及超声信号。

1.2.5激发能量对细胞损伤作用 将MH7A滑膜成纤维细胞种于96孔板，分为阴性对照组、低能量激光组与高能量激光组，用532 nm激光器激发IPNPs及IHNPs发生相变的临界能量作用于细胞，24 h后采用MTT法检测细胞活性，光镜观察细胞形态。实验重复3次。

2 结果

2.1一般特性及稳定性 制备后重悬的纳米粒呈均一的淡绿色，光镜下观察均呈球形，形态规则，大小均一，分散度好(图1A～1C)。激光粒径仪测得IPNPs-IHNPs的平均粒径分别为(490.53±36.96)nm和(512.23±38.52)nm，电位分别为(-14.40± 1.40)mV和(-13.97±1.61)mV，二者差异无统计学意义。紫外分光光度计测得PNPs及HNPs在600～850 nm范围内均无明显吸收峰，而IPNPs、IHNPs及ICG水溶液在780 nm左右均有明显吸收峰(图1D)。37℃储存24 h，再次测定二者平均粒径分别为 (497.70±76.24)nm及(548.93±73.80) nm，电位分别为 (-13.7±4.01) mV及(-13.6±1.78)mV，与24 h前无明显变化。光镜观察IPNPs只有少量相变，IHNPs未见明显相变，且二者分散度均良好(图1E、1F)。

2.2热致相变 温度达43℃时，IPNPs开始相变，加热至47℃时观察到大量相变(图2A、2B)。而IHNPs相变发生温度需达到70℃，加热至75℃可观察到大量相变(图2C、2D)，两种纳米粒相变后均成为微米级的气泡，并逐渐漂浮聚集，部分膨胀破裂。

图1 两种纳米粒的一般特性及稳定性 A.IPNPs及IHNPs大体图； B.IPNPs光镜图(×600)； C.IHNPs光镜图(×600)； D.游离ICG及各纳米粒光谱图； E.IPNPs于37℃水浴锅中放置24 h光镜图(×100)； F.IHNPs于37℃水浴锅中放置24 h光镜图(×100)

图2 热致相变图 A.IPNPs加热前； B.IPNPs加热后； C.IHNPs加热前； D.IHNPs加热后

2.3光致相变 激光(频率3 Hz，强度160 mJ)辐照10 s，IPNPs即发生大量相变，停止激光辐照，可见相变后的IPNPs逐渐增大，部分未相变的纳米粒开始增大转变为微泡(图3A、3B)。而IHNPs需将强度增至400 mJ才可大量相变(图3C、3D)。

2.4 LIFU致相变 当LIFU能量增至5 W，辐照 5 min时，IPNPs开始发生相变(图4A、4B)，液体液面上层可见一层漂浮气泡。将时间延长至15 min，也未能观察到IHNPs明显的造影信号(图4C、4D)。定量结果显示IPNPs辐照前后平均灰度值差异有统计学意义(P<0.05)，而IHNPs激发前后平均灰度值差异无统计学意义(P>0.05,图4E)。

2.5光声及超声成像观察 光声成像系统以光声模式激发2 min后，IPNPs可检测到明显的造影信号，且光声信号显著增强，继续激发至4 min，仍可观察到明显的光声及造影信号。而IHNPs在激发2 min后未见造影信号及光声信号增强，激发时间延长至5 min，观察到明显的造影信号及光声信号。见图5。

图3 光致相变图 A.IPNPs激发前； B.IPNPs激发后(160 mJ，10 s)； C.IHNPs激发前； D.IHNPs激发后(400 mJ，10 s)

图4 LIFU致相变图 A.IPNPs辐照前二维超声及谐波图像； B.IPNPs辐照后二维超声及谐波图像； C.IHNPs辐照前二维超声及谐波图像； D.IHNPs辐照后二维超声及谐波图像； E.辐照前后平均灰度定量测量结果

图5 纳米粒光声图 IPNPs分别激发0、2、4 min的超声模式(A～C)、造影模式(G～I)及光声模式图(M～O)； IHNPs分别激发0、2、5 min的超声模式(D～F)、造影模式(J～L)及光声模式图(P～R)

图6 单纯脉冲激光对MH7A细胞的细胞毒性 A～C.分别为对照组、低能量激光组、高能量激光组光镜图(×100)； D.低能量激光组与高能量激光组细胞存活率

2.6 细胞毒性 低能量激光组(致IPNPs大量相变)对细胞存活率无明显影响，而高能量激光组(致IHNPs大量相变)对细胞产生显著的细胞毒性，存活率分别为(95.34±7.96)%、(54.92±6.11)%，二者差异有统计学意义(P<0.05,图6)。

3 讨论

本研究采用改良的双乳化法制备的IPNPs和IHNPs，发现在外观形态、粒径、电位方面均无明显差别；吸收光谱结果示IPNPs及IHNPs在780 nm左右有强吸收，与ICG的紫外分光光谱一致，提示ICG在形成纳米粒的过程中光学特性未发生改变；37℃放置 24 h，IPNPs只有少量发生相变，且粒径及电位未见明显改变，可能是这部分纳米粒粒径较大，内部拉普拉斯压力较小所致(该压力与半径呈反比)[12]，IHNPs未见明显相变，二者分散度均良好，未发生明显聚集。提示两种纳米粒均较稳定。

研究[11,14-15]表明，温度、超声、激光等因素均可引起液态氟碳纳米粒的相变，因此，本研究从这几个方面比较两种纳米粒的相变特性。热致相变结果提示，IPNPs及IHNPs发生大量相变的温度分别为47℃和75℃，相变后成为微米级微泡。液气相变的温度高于沸点温度，与陈澄等[13,15]的研究结果一致，原因可能是由于内部拉普拉斯压力的影响而使相变温度增高。光致相变结果显示，激光致IPNPs及IHNPs发生大量相变的强度分别为160 mJ、10 s和400 mJ、10 s，停止激光激发，仍有大量纳米粒相变，相变后的纳米粒逐渐增大，部分发生膨胀爆裂，相变的原因可能是ICG吸收光能，转化为热能使纳米粒迅速升温所致。光致相变结果提示IPNPs纳米粒相变所需能量较低，更易激发。LIFU时5 W辐照5 min可观察到IPNPs发生相变，而辐照时间即使延长至15 min，IHNPs仍不能相变，同样提示IPNPs纳米粒的易激发相变特性。体外光声成像结果显示二者在808 nm激光辐照下(20 Hz)均可发生大量相变，增强超声造影信号及光声信号，但IHNPs信号增强的激发时间明显长于IPNPs，同时，在相同激发条件下，IPNPs增强光声及超声成像的能力高于IHNPs。此外，本研究采用MTT实验和光镜观察测定了光致IPNPs相变 (160 mJ， 10 s)及IHNPs相变(400 mJ， 10 s)的激光能量对细胞的毒性作用，结果提示，光致IPNPs相变能量无明显的细胞损伤作用，而光致IHNPs相变能量能够明显抑制细胞活性，因此，IPNPs可能有更高的安全性。

综上所述，包裹ICG及PFP或PFH的相变型多功能纳米粒理化性质无明显差别，体外有较好的稳定性，但IPNPs比IHNPs有更好的相变特性，具有更强的成像增强能力和更高的安全性。因此，IPNPs可能是一种更有前景的多功能诊疗一体化纳米粒。

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国家自然科学基金(81572558、81372799)、重庆市研究生科研创新项目(2015-139)。

唐琴(1991—)，女，四川成都人，在读硕士。研究方向：多功能微泡/光动力疗法。E-mail: tangqin0212@sina.com

朱深银，重庆医科大学附属第一医院药学部，400016。E-mail： zhushenyin0486@sina.com

2016-05-31

2016-07-15

两种相变型多功能纳米粒的制备及体外特性比较

唐 琴1,2，3，朱深银1*，常淑芳4，崔健毓1,2，田中华1，孙江川4，王志刚2，邱 峰1

(1.重庆医科大学附属第一医院药学部，重庆 400016；2.重庆医科大学超声分子影像学研究所，重庆 400010；3.超声医学工程重庆市重点实验室，重庆 400016；4.重庆医科大学附属第二医院妇产科，重庆 400010)

目的 制备包裹吲哚菁绿(ICG)及不同相变材料[全氟正戊烷(PFP)或全氟己烷(PFH)]的两种相变型多功能纳米粒，比较其理化性质、稳定性及体外相变特性。方法 采用改良的双乳化法制备包裹ICG及液态PFP或PFH的乳酸-羟基乙酸(PLGA)纳米粒(分别称为IPNPs、IHNPs)，比较两者的一般特性、稳定性及热致相变、光致相变、声致相变和光声成像能力，采用MTT法检测光致相变所需能量的细胞毒性。结果 IPNPs及IHNPs粒径分别为(490.53±36.96)nm及(512.23±38.52)nm，电位分别为(-14.40±1.40)mV及(-13.97±1.61)mV，二者差异无统计学意义(P均>0.05)；二者形态、吸收光谱也均无明显差异，于37℃储存24 h均较稳定；IPNPs热致相变、光致相变及声致相变所需能量均低于IHNPs，且IPNPs光声及超声成像增强能力高于IHNPs。经能使IPNPs及IHNPs发生相变的激光能量辐照后，MH7A细胞存活率分别为(95.34±7.96)%，(54.92±6.11)%,二者差异有统计学意义(P<0.05)。结论 IPNPs是更适于诊疗一体化应用的多功能纳米粒。

多功能纳米粒；氟碳化合物；相变；成像

R445.2

A

1672-8475(2016)10-0636-06

10.13929/j.1672-8475.2016.10.013