垂体腺瘤MRI Knosp分级与Ki-67、p53、MMP-9的相关性分析

何璐 郭亮 胡春洪 虞正权 惠国祯*

(苏州大学第一附属医院: 1医学影像科; 2神经外科，江苏 苏州 215006)

·论著·

垂体腺瘤MRI Knosp分级与Ki-67、p53、MMP-9的相关性分析

何璐1郭亮1胡春洪1虞正权2惠国祯2*

(苏州大学第一附属医院:1医学影像科;2神经外科，江苏 苏州 215006)

目的检测增殖细胞核抗原Ki67(Ki-67)、抑癌基因p53(p53)及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)在侵袭性及非侵袭性垂体瘤中的表达变化，探讨它们与Knosp分级的相关性。方法选用垂体瘤179例，根据Knosp分级分为侵袭性组(n=91)和非侵袭性组(n=88)，应用免疫组化方法检测标本中Ki-67、p53及MMP-9的表达情况。结果p53、Ki-67和MMP-9在Knosp分级Ⅲ级以上组中显著增高(Plt;0.01)。结论Ki-67、 p53和MMP-9表达与Knosp分级呈正相关。

垂体瘤; Knosp分级; 增殖细胞核抗原Ki67; 抑癌基因p53; 基质金属蛋白酶-9

垂体瘤是颅内常见的肿瘤之一，约占颅内肿瘤的10%左右，垂体瘤在形态上属于良性肿瘤，但有部分肿瘤呈侵袭性生长。侵袭性垂体瘤约占垂体瘤总数的6%～17%。侵袭性垂体瘤具有高增殖性、呈侵袭性生长、低治愈率及高复发率的特点，因此探究肿瘤的侵袭性标记是近来研究的热点。Knosp等根据垂体瘤冠状位MRI海绵窦受侵犯的程度提出了Knosp分级法，是目前常用的垂体瘤分级方法。我们应用免疫组化方法，分别检测标本中Ki-67、p53及基质金属蛋白酶-9(matrix metallo preteinases-9, MMP-9)的表达情况，并分析它们与Knosp分级的相关性，以期对垂体瘤的诊断及治疗提供更多帮助。

对象与方法

一、一般资料

选取了2011年1月至2015年12月苏州大学附属第一医院神经外科治疗的垂体瘤病例共179例，年龄15到85岁。其中，男性94例，女性85 例，平均年龄(52.52±15.02)岁。所有样本均经组织学检查。

二、临床表现

主要症状是非特异性头痛，视力、视野缺损，性功能减退、性欲下降。20例女性患者还有月经量减少、闭经、溢乳等症状。

三、影像学检查

侵袭性垂体瘤的判断标准按照Knosp分级法。术前根据MRI海绵窦是否有明确侵犯，依照Knosp分级标准分为五级：①0级，海绵窦未受侵，肿瘤局限在鞍内及颈内动脉内侧壁连线内；②Ⅰ级，肿瘤位于颈内动脉连线之内，内侧静脉丛受侵已消失；③Ⅱ级，肿瘤位于颈内动脉外侧壁连线内侧，内侧和上方或下方的静脉丛已消失；④Ⅲ级，肿瘤长到颈内动脉外侧壁连线外侧，突到海绵窦外，海绵窦内各静脉丛消失，海绵窦外侧腔消失；⑤Ⅳ级，海绵窦内颈内动脉被肿瘤包裹，静脉丛消失。肿瘤包绕颈内动脉达67%以上、海绵窦累及即可确诊侵袭性垂体瘤。因此，Knosp分级0～Ⅱ级属于非侵袭性，Ⅲ～Ⅳ级属于侵袭性。

四、治疗

179例患者均接受经鼻蝶窦显微外科手术治疗。术中根据肿瘤的发展方向、鞍膈下降、质地等进行判断，尽量全切肿瘤。术后无脑脊液鼻漏、感染、死亡病例。术后病理显示179例患者均为垂体腺瘤。

五、免疫组化试验方法

采用免疫组化二步法检测，兔抗人增殖细胞核抗原Ki-67(Ki-67)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和小鼠抗人抑癌基因p53(p53)单克隆一抗及多克隆二抗均购自上海基因生物技术公司代理DAKO公司产品。以磷酸盐缓冲液(phosphate buffer solution)代替一抗作阴性对照，已知阳性片作为阳性对照，光学显微镜观察着色反应。Ki-67阳性表达于细胞核，p53阳性表达于细核，MMP-9阳性表达于细胞质及细胞膜。应用罗氏公司全自动免疫组化仪检测结果。阳性细胞的阳性强度按无着色、淡黄色、棕黄色及棕褐色打分为0、1、2、3分。着色阳性细胞按无着色、着色0%～30%、gt;30%～60%、gt;60%～100%分别打0、1、2、3分。两项打分之和：0～1分为阴性，2分为弱阳性，3～4分为阳性，5分以上为强阳性。

六、统计方法

应用SPSS 18.0软件包进行统计学分析，主要指标均进行正态性检验，正态分布的各统计指标均以SD来表示。两独立样本的t检验，采用双侧Plt;0.05为差异具有统计学意义。相关性统计学分析采用Spearman法，采用双侧Plt;0.01为差异具有统计学意义。回归分析采用多因素Logistic回归分析，采用双侧Plt;0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、Knosp分级

将179例患者分为如下五级，其中0～Ⅱ级为非侵袭性垂体瘤，共88例，Ⅲ～Ⅳ级为侵袭性垂体瘤，共91例(图1)。

二、免疫组化显色

免疫组化染色中，0级24例，Ⅰ级40例，Ⅱ24例， Ki-67以细胞核染色为阳性细胞(图2)，其中，Ⅲ级45例，Ⅳ级46例。p53染色以细胞核染色为主(图3)，MMP-9以细胞质及细胞膜染色为主，阳性染色为棕黄色细颗粒(图4)。

三、侵袭性与非侵袭性组中Ki-67、p53及MMP-9表达情况

根据Knosp分级，侵袭性与非侵袭性组中的Ki-67、p53及MMP-9表达的差异有统计学意义(Plt;0.05)(表1)。

KnospclassificationnKi⁃67p53MMP⁃9 0～Ⅱ881．01±1．020．563±0．1480．732±0．082 Ⅲ～Ⅳ913．56±1．84a1．478±0．087b1．653±0．139c

t=-10.07，aPlt;0.05,vsKnosp 0～Ⅱgroup;t=-3.477，bPlt;0.05,vsKnosp 0～Ⅱgroup;t=-6.008,cPlt;0.05,vsKnosp 0～Ⅱgroup.

表2 垂体瘤侵袭性发生影响因素的Spearman相关性分析结果

Tab 2 The Spearman correlation analysis of pituitary adenoma invasive influence factors

FactorKnospclassificationrP Ki-670．592lt;0．01 p530．362lt;0．01 MMP-90．426lt;0．01

表3 Logistic多因素回归分析结果

Tab 4 Results of multivariate Logistic regression analysis

RiskfactorβStandarderrorWaldP Ki⁃67﹣2．1790．3269．1350．003 p53﹣1．2440．1271．5190．047 MMP⁃9﹣3．570．2027．5460．023

四、Spearman等级相关分析

Ki-67(r=0.592，Plt;0.01)、p53(r=0.362，Plt;0.01)及MMP-9(r=0.426，Plt;0.01)的表达水平与垂体瘤的Knosp分级呈正相关(表2)。

五、Logistic多因素回归分析

Ki-67(P=0.003)、p53(P=0.047)及MMP-9(P=0.023)均是垂体瘤侵袭性的独立危险因素，且差异有统计学意义(见表3)。

图1 非侵袭性垂体瘤与侵袭性垂体瘤MR表现

Fig 1 MR images of non-invasive and invasive pituitary adenoma

A: MR image of non-invasive pituitary adenoma showed the lesion was limited in the saddle area; B：MR image of invasive pituitary adenoma showed that the lesion extends to the saddle.

图2 免疫组化显示非侵袭性及侵袭性垂体瘤肿瘤组织的Ki-67表达情况

Fig 2 Expression of Ki-67 in non-invasive and invasive pituitary adenomas by immunohistochemistry (×40)

The positive staining were brown granulesin tumor cells nucleus.

A: Expression of Ki-67 in non-invasive pituitary adenomas by immunohistochemistry; B: Expression of Ki-67 in invasive pituitary adenomas by immunohistochemistry.

图3 免疫组化显示非侵袭性及侵袭性垂体瘤肿瘤组织的p53表达情况

Fig 3 Expression of p53 in non-invasive and invasive pituitary adenomas by immunohistochemistry (×40)

The positive staining were brown granulesin tumor cells nucleus.

A: Expression of p53 in non-invasive pituitary adenomas by immunohistochemistry; B: Expression of p53 in invasive pituitary adenomas by immunohistochemistry.

图4 免疫组化显示非侵袭性及侵袭性垂体瘤肿瘤组织的MMP-9表达情况

Fig 4 Expression of MMP-9 in non-invasive and invasive pituitary adenomas by immunohistochemistry (×40)

The positive staining were brown granulesin tumor cells nucleus.

A: Expression of MMP-9 in non-invasive pituitary adenomas by immunohistochemistry; B: Expression of MMP-9 in invasive pituitary adenomas by immunohistochemistry.

讨 论

侵袭性垂体瘤较非侵袭性垂体瘤在生物学上具有高侵袭性，生长速度快的特点。垂体瘤可以侵袭海绵窦、鞍底骨质和蝶窦，其中以海绵窦受累为重要征象。MRI上，海绵窦两侧信号强度不对称是海绵窦受侵犯的最敏感的征象，但其特异性差；颈内动脉海绵窦段受包绕，特异性高，但敏感性差。因此，我们引用Knosp分级法[1,2]，如果肿瘤包绕颈内动脉达67%以上，海绵窦累及可以诊断，侵袭性的阳性预测率为100%；如果海绵窦显示不清或海绵窦上、内侧壁与肿瘤相连，则高度怀疑；如果肿瘤包绕颈内动脉小于25%或颈内动脉上、内侧壁未与肿瘤接触，则可以明确海绵窦未累及。因此，MRI已成为评价垂体肿瘤最好的影像学方法。我们可以根据肿瘤的MRI影像学特点，对垂体瘤的侵袭性做出初步判断。

Ki-67是一种与DNA结合的核内蛋白，因其只表达于细胞增殖各期，不易受生长因子诱导，能够较好的判断肿瘤的生长增殖特性[2,3]。Thapar[4]提出，以3%指数作为区分侵袭性与非侵袭性腺瘤的阈值。本文结果显示Ki-67表达与Knosp分级呈正相关。Knosp[5]等发现，垂体腺瘤中，Ki-67表达指数越高，其侵袭性越强。最新研究表明，Ki-67与垂体瘤的侵袭性呈正相关，而与垂体瘤的复发并无明显关联[3]。Ki-67可作为判断肿瘤侵袭性的指标之一。

与侵袭性垂体瘤相关的抑癌基因主要包括Rb基因、p53基因和MEN-1基因等，其中，p53是目前研究最多的抑癌基因。p53基因可以分为野生型和突变型两种。研究发现，野生型的p53可以抑制肿瘤的发生，但其为潜在的形式，平时维持较低的水平[6]。同时，p53也是肿瘤发生中最常见发生突变和变异的抑癌基因，突变后的p53能够刺激细胞生长，促进肿瘤的发生[7]。Thapar等[4]提出，侵袭性垂体腺瘤组织中p53的表达较高，而非侵袭性垂体腺瘤组织中表达较低。因此，p53基因的异常表达是侵袭性垂体腺瘤的重要标志。本研究也证实p53的表达与Knosp分级呈正相关。

MMP-9属于胶质酶Ⅳ，具有溶解基底膜的胶原Ⅳ和细胞外基质的能力，并能够诱导细胞有丝分裂及参与新生血管网的形成。同时，MMP-9与转移瘤及某些恶性肿瘤包括脑肿瘤的侵袭性密切相关[8]。文中结果表明，MMP-9表达与Knosp分级呈正相关。此外，MMP-9在垂体腺瘤的侵袭性生长中起重要促进作用。Kawamoto[9,10]等研究认为，MMP-9不仅与垂体瘤的侵袭性密切相关，而且与肿瘤的复发和转移有关，也可作为肿瘤侵袭性和复发的指标。有研究表明，指导个体化临床治疗抑制MMP-9的活性作用或减少其分泌，可作为治疗侵袭性垂体瘤的一个新靶点。

目前已有很多研究表明，垂体肿瘤是单克隆起源的，有多种因素参与垂体肿瘤的形成。大部分的垂体腺瘤是良性的，不会转移，但也有一些会侵袭邻近组织。目前对垂体瘤侵袭机制及影响垂体瘤侵袭性因素的研究，仍是热点。垂体的侵袭性的发生是一个长期的、多因素、多步骤的过程。术后并发症、内分泌方面未能获得缓解、以及患者的预后与侵袭性密切相关，不同的因素在垂体瘤的启动和进展中发生拮抗或者协同的作用。本文研究表明，Ki-67、p53及MMP-9均与Knosp分级一致呈正相关，即侵袭性垂体瘤中Ki-67、p53及MMP-9三者表达均显著高于非侵袭性垂体瘤。同时，Ki-67、p53及MMP-9标本容易获得，对于实验室的设备要求一般，适用于临床的研究，且MMP-9可作为肿瘤复发的判断指标。因此，联合Ki-67、p53、MMP-9表达的检测及Knosp分级对提高垂体腺瘤侵袭性判断的特异性及预后有重要价值。

1Knosp E, Steiner E, Kitz K, et al. Pituitary adenomas with invasion of the cavernous sinus space: a magnetic resonance imaging classification compared with surgical findings [J]. Neurosurgery, 1993, 33(4): 610-618.

2惠国祯, 主编. 垂体瘤 [M]. 第2版. 北京: 人民军医出版社, 2011: 152-158.

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5Knosp E, Perneczky A, Kitz K, et al. The need for adjunctive focused radiation therapy in pituitary adenomas [M]. Acta Neurochir Suppl, 1995, 63: 81-84.

6Gejman R, Swearingen B, Hedley-Whyte ET. Role of Ki-67 proliferation index and p53 expression in predicting progression of pituitary adenomas [J]. Human Pathol, 2008, 39(5): 758-766.

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9Kawamoto H, Uozumi T, Kawamoto K, et al. Type IV collagenase activity and cavernous sinus invasion in human pituitary adenomas [J]. Acta Neurochirurgica, 1996, 138(4): 390-395.

10Qiu L, He D, Fan X, et al. The expression of interleukin (IL)-17 and IL-17 receptor and MMP-9 in human pituitary adenomas [J]. Pituitary, 2011, 14(3): 266-275.

ThecorrelationbetweenMRIKnospclassificationandKi-67,p53andMMP-9inpituitaryadenoma

HELu1,GUOLiang1,HUChunhong1,YUZhengquan2,HUIGuozhen2

1DepartmentofMedicalImaging;2DepartmentofNeurosurgery,FirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversity,Suzhou215600, China

ObjectiveThe expressions of Ki-67, p53 and MMP-9 in the pituitary adenomas were detected to study the correlation between them and Knosp classification.MethodsOne hundred and seventy-nine cases of pituitary tumor specimens were divided into two groups by Knosp classification, including ninty-one cases of invasive pituitary adenoma and eighty-eight cases of non-invasive pituitary adenoma. The expressions of proliferation-related Ki-67 antigen (Ki-67), tumor suppressor gene p53 (p53) and matrix metalloproteinase 9 (MMP-9) were detected by immunohistochemistry.ResultsThe rates of Ki-67, p53 and MMP-9 were higher than those in the groups above Knosp classification Ⅲ (Plt;0.01).ConclusionThere is significant positive correlation between Ki-67, p53, MMP-9 and Knosp classification.

Pituitary adenoma; Knosp classification; Ki-67; p53; MMP-9

1671-2897(2016)15-410-04

R 736.4

A

国家973基金资助项目(2012CB518106)

何璐，医师，E-mail：20114232125@suda.edu.cn

*通讯作者： 惠国祯，教授、主任医师，博士生导师，E-mail：guozhen-hui@163.com

2016-04-16；

2016-07-27)