雌激素受体及多巴胺受体在泌乳素腺瘤的表达

董家军 彭逸龙 王海清 钟鸣谷 伍益

(江门市中心医院神经外科，广东 江门 529030)

·脑肿瘤基础与临床研究·

雌激素受体及多巴胺受体在泌乳素腺瘤的表达

董家军*彭逸龙 王海清 钟鸣谷 伍益

(江门市中心医院神经外科，广东 江门 529030)

目的研究雌激素受体(ESR)及其亚型mRNA、多巴胺受体(D2R)及其亚型mRNA在泌乳素腺瘤中的表达。方法应用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)测定30例泌乳素腺瘤标本ESR1mRNA、ESR2mRNA、第五外显子缺失的1型雌激素受体(△5-Del-ESRl mRNA)及D2RmRNA的表达，研究其表达水平与患者性别、肿瘤体积、侵袭性及泌乳素(PRL)水平的关系。结果男性和绝经后女性患者肿瘤ESR1 mRNA表达高于育龄女性患者；侵袭性泌乳素腺瘤高于非侵袭性肿瘤；PRL≥1 000 ng/ml的患者△5-Del-ESRl mRNA表达水平较PRLlt;1 000 ng/ml的患者明显增高。D2RmRNA异构体的表达水平与泌乳素腺瘤生物学行为有关系，D2SmRNA的表达水平在侵袭性与非侵袭性泌乳素腺瘤中存在显著差异，D2SmRNA在侵袭性泌乳素腺瘤中呈低水平表达。结论ESR1及其亚型△5-Del-ESRl mRNA、D2R及其亚型mRNA表达与泌乳素腺瘤PRL分泌及肿瘤侵袭有关。

雌激素受体; 多巴胺受体受体; 第五外显子缺失的1型雌激素受体; 泌乳素腺瘤

泌乳素腺瘤是最常见的功能性垂体腺瘤，约占所有功能性垂体腺瘤的40%～60%，亦是唯一首选为药物治疗的垂体瘤。但其发生、发展的确切机制仍不甚明了，目前大量研究证实雌激素受体及其亚型、多巴胺受体及其亚型在其中起着重要的作用[1,2]。本课题旨在揭示雌激素受体、多巴胺受体在泌乳素瘤发生、发展中的地位和作用并探讨其可能的机制。

材料与方法

一、临床资料

30例泌乳素瘤标本取自2010年1月至2015年6月间江门市中心医院神经外科手术切除标本。标本切除后30 min内分块置于液氮罐内冷冻贮存。所有垂体瘤标本均经常规病理及免疫组化检查确诊为泌乳素腺瘤(江门市中心医院病理科协助完成)。30例泌乳素瘤患者中，男性l0例，绝经后女性5例，育龄女性15例；年龄25～65岁，平均(37.6±9.8)岁；泌乳素(prolactin, PRL)水平210～560 ng/ml，平均1 103.25 ng/ml；微腺瘤1例，大腺瘤21例，巨大腺瘤8例；Knosp分级≥2者18例(垂体肿瘤侵袭海绵窦为侵袭性垂体)，lt;2者12例。

二、主要试剂

Trizol Reagent购自Invitrogen公司；逆转录酶、RT-PCR预混液、1型雌激素受体，(estrogen receptor type1, ESRl)、 2型雌激素受体，(estrogen receptor type 2, ESR2)、内参基因β-actin引物和探针均购自ABI公司；△5-Del-ESRl mRNA (第五外显子缺失的1型雌激素受体，5th Exon deleted estrogen receptor type 1)引物和探针由ABI公司设计、合成并检测、优化(表1)。采用ABl7500系统进行RT-PCR反应。

表1 ABI公司设计合成的基因引物和探针及其参考序列
Tab 1 Synthetic gene primers and probe and the reference sequence designed by ABI company

GenePrimerandprobeReferencesequenceName ESR1Hs01046815＿mlNM＿000125．2Estrogenreceptortype1 ESR2Hs00230957＿mlNM＿001040275．1Estrogenreceptortype2 D2RLHs01024460＿mlNM＿00795．2DopaminergicD2receptorlongisoform D2RSHs01014210＿mlNM＿016574．2DopaminergicD2receptorshortisoform

Δ5-Del- ESR1 Forward:5'ACATGATCAACTGGCGAAGA3'; 5th Exon Deleted Estrogen ReceptorType1; Reverse: 5'ACCATGCCCTCTACACA TTTTCC3'; Probe: FAM5CTGGTTCCTGGCACC 3NRQ

三、方法

Trizol法提取总RNA，其步骤按照Invitrogen公司提供的商品说明书进行。用分光光度计测定其浓度和纯度。逆转录合成cDNA，反应体系为50 μl，其中RNA样本25 μl，缓冲液5 μl，随机引物5 μl，dNTP 2 μl，逆转录酶2.5 μl，RNA酶抑制剂2.5 μl，焦碳酸二乙酯(diethypyrocarbonate, DEPC)水8 μl。反应条件：25℃ l0 min，37℃ 120 min，85℃ 5 min，上机反应后冰上冷却，得到cDNA溶液。然后进行RT-PCR反应，反应体系为25 μl，其中预混液12.5 μl，探针、引物1.25 μl，cDNA模板1 μl，DEPC水10.25 μl。反应条件：95℃，15 S；60℃，1 min (40个循环)。引物中G-C含量均满足通常要求，其相应PCR产物均为相应基因的外显子片段，从而保证其检测到的PCR产物是来自RNA模板，排除基因组DNA污染造成的假阳性。所有基因均设3个复孔，重复三次实验，用来估计批内差异。不同样品间基因表达的差异采用ABI公司推荐的相对定量方法进行计算，通过ABI7500系统中相对定量分析软件，分析所得到的结果。

四、统计学分析

所有计量数据均以(均数±标准差)表示。采用SPSS 17.0统计学软件进行分析，采用独立样本t检验和方差分析比较各组的均数，逐步回归法分析各基因表达的相关性。Plt;0.05代表差异有统计学意义。

结 果

一、ESR mRNA 的表达

ESR1 mRNA在所有泌乳素腺瘤患者中均有表达。 ESR2 mRNA亦在泌乳素腺瘤中检测到表达，表达水平为ESR1mRNA的1.5%左右。ESR2 mRNA表达水平与PRL水平、肿瘤体积及肿瘤侵袭性均无相关。

二、ESR1mRNA表达与性别的关系

本组男性和绝经后女性21例，育龄女性9例， 前者ESR1mRNA表达高于育龄女性患者组(P=0.008)。

三、ESR1 mRNA表达与PRL水平的关系

ESR1mRNA表达水平与PRL的对数值(Log PRL)呈正相关，线性方程为LogPRL=0.426 ESRl mRNA+1.853，R2=0.528。

四、ESRl mRNA表达与肿瘤体积及侵袭的关系

ESR1mRNA表达水平与肿瘤体积相关(Plt;0.05)，但巨大腺瘤组患者ESR1 mRNA表达水平与大腺瘤组无明显差异，(Pgt;0.05)。侵袭性垂体瘤(Knosp分级≥2)ESRlmRNA表达高于非侵袭性垂体瘤( Knosp分级lt;2)，(Plt;0.05)。

五、△5-Del-ESRl mRNA表达

所有泌乳素腺瘤中均检测到△5-Del-ESRl mRNA的表达，表达水平为ESRl的3.5%±0.6%。男性患者与女性患者表达水平无明显差异。△5-Del-ESRl mRNA在PRL≥1 000 ng/ml的患者较PRLlt;1 000 ng/ml的患者中表达水平明显增高(Plt;0.05)。△5-Del-ESRl mRNA与肿瘤体积无相关(Pgt;0.05)。△5-Del-ESRl mRNA的比值男女性患者无差异(Pgt;0.05)。

六、D2RS mRNA和D2RL mRNA表达

在所有泌乳素腺瘤患者中均有表达。D2RmRNA异构体的表达水平与垂体PRL腺瘤生物学行为有关，D2SmRNA的表达水平在侵袭性与非侵袭性泌乳素腺瘤中存在显著差异(Plt;0.05)，D2SmRNA在侵袭性PRL腺瘤中呈低水平表达。

讨 论

ESR包括两种亚型ESRl和ESR2，本次研究发现泌乳素腺瘤中ESR2 mRNA的表达水平仅为ESRl的1.5%，与性别、PRL水平、肿瘤体积无相关性，提示ESR2在泌乳素腺瘤的发生、发展过程中作用不大。ESRl在垂体腺瘤中高表达，提示ESR1对泌乳素腺瘤的发生、发展起主导作用。

本次研究中发现侵袭性泌乳素腺瘤ESR1 mRNA表达水平高于非侵袭性腺瘤，提示ESRl参与肿瘤侵袭。其部分机制依赖于ESRl可以促进垂体肿瘤转化基因(pituitary tumor transforming gene, PTTG)和 血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的表达[3]。PTTG可抑制染色单体的分离，影响肿瘤基因组的整倍性，并促碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor, b-FGF)的分泌，调节肿瘤血管形成、肿瘤转化和发展，促进PRL的合成和分泌。VEGF的高表达则可以诱导异常血管的形成，提高肿瘤侵袭性。

关于“在雌激素水平低下的男性和绝经后女性会发生泌乳素腺瘤，且多为大腺瘤”的现象，一直颇有争议[4,5]。本实验中观察到男性和绝经后女性患者组ESR1 mRNA表达高于育龄女性患者组，这较好的解释了上述问题。

有研究证实△5-Del-ESRl mRNA在泌乳素瘤中的表达，△5-Del-ESRl mRNA蛋白缺乏配体结合域，保留了AF-1激活域和DNA绑定结合域，能够不依赖于雌激素持续激活靶基因转录[6]。一些研究表明在子宫内膜癌中△5-Del-ESRl mRNA的表达也较正常内皮细胞升高[7]。本次实验中观察到△5-Del-ESRl mRNA在所有泌乳素腺瘤中表达，PRL≥1 000 ng/ml的患者较PRLlt;1 000 ng/ml的患者表达水平明显增高，表明该型变异体参与泌乳素瘤PBL分泌的调控，其调控泌乳素瘤作用还需进一步的研究。

多巴胺能受体D2基因(dopaminergic receptor-D2gene)染色体上位点位于11q23。D2R有2种亚型即长受体D2RL(long)和短受体D2RS(short)，该受体由87bp外显子的选择性剪接所形成，其区别在于第三个胞质环是否多出了29个氨基酸残基[8,9]。

本实验证实：D2R在所有泌乳素腺瘤患者中均有表达。D2RmRNA异构体的表达水平与垂体PRL腺瘤生物学行为有关，D2SmRNA的表达水平在侵袭性与非侵袭性PRL腺瘤中存在显著差异，D2SmRNA在侵袭性PRL腺瘤中呈低水平表达。雌激素还通过抑制下丘脑分泌多巴胺并下调D2R受体的表达，促进PRL的分泌，有研究证明溴隐亭治疗无效的泌乳素瘤患者肿瘤中常有较高的ESR mRNA表达。D2R基因低表达及mRNA交替剪接修饰致多巴胺D2受体水平下降，D2S受体亚性表达下降尤为明显，致D2受体两个异构体D2S/D2L比值下降，进而导致垂体PRL腺瘤对溴隐亭的耐药性。此外。Kelly等证实D2R基因缺失的大鼠的PRL细胞增殖明显且具有较强的侵袭性。也有文献证实发现D2SmRNA在侵袭性PRL腺瘤中呈低水平表达，并认为这一差异致使侵袭性PRL腺瘤较非侵袭性PRL腺瘤更易对多巴胺受体激动剂耐药。

本次研究发现ESR1及其亚型△5-Del-ESRl mRNA、D2R及其亚型mRNA表达与泌乳素腺瘤的发生、发展有关，但其具体机制还需进一步的研究。

1Ezzat S, Asa SL, Couldwell WT, et a1. The prevalence of pituitary adenomas: a systematic review [J]. Cancer, 2004, 101(3): 613-619.

2Heaney AP, Horwitz GA, Wang Z, et al. Early involvement of estrogen-induced pituitary tumor transforming gene and fibrob-last growth factor expression in prolactinoma pathogenesis [J]. Nat Med, 1999, 5(11): 1317-1321.

3McCabe CJ, Boelaert K, Tannahill LA, et al. Vascular endothelial growth factor, its receptor KDR/FLK-1,and pituitary tumor transforming gene in pituitary tumors [J]. J Clin Endocrinol Metab, 2002, 87(9): 4238-4244.

4Zafar M, Ezzat S, Ramyar L, et al. Cell-specific expression of estrogen receptor in the human pituitary and its adenomas [J]. J Clin Endocrinal Metab, 1995, 80(12): 3621-3627.

5Donangelo I, Melmed S. Implication of pituitary tropic status on tumor development [J]. Front Horm Res, 2006, 35(1): 1-8.

6Fuqua SA, Fitzgerald SD, Chamness GC, et al. Variant human breast tumor estrogen receptor with constitutive transcriptional activity [J]. Cancer Res, 1991, 51(1): 105-109.

7Horvath G, Leser G, Hahlin M, et al. Exon deletions and variants of human estrogen receptor mRNA in endometrial hyperplasia and adenocarcinoma [J]. Int J Cynecol Cancer, 2000, 10(2): 128-136.

8Vangveravong S, McElveen E, Taylor M, et al. Synthesis and characterization of selective dopamine D2 receptor antagonists [J]. Bioorg Med Chem, 2006, 14(3): 815-825.

9Lan H, Durand CJ, Teeter MM, et al. Structural determinants of pharmacological specificity between D1 and D2 dopamine receptors [J]. Mol Pharmacol, 2006, 69(1): 185-194.

mRNAexpressionofestrogenreceptoranddopaminereceptorwiththeirsubtypesinprolactionoms

DONGJiajun,PENGYilong,WANGHaiqing,ZHONGMinggu,WUYi

DepartmentofNeurosurgery,CentralHospitalofJiangmenCity,Jiangmen529030, China

ObjectiveThe mRNA expressions of estrogen receptor (ESR) and dopamine receptor (D2R) with their subtypes in prolactionoms are discussed.MethodsThe mRNA expressions of ESR and D2R with their subtypes in 30 prolactionoms samples was detected with reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) to study the relationship between sex, tumor volume, invasion and PRL level and the its expression.ResultsESRl mRNA had a higher expression in male and postmenopausal female patients than those in fertile female and its level of invasive prolactionoms were higher than that of noninvasive tumors．The ESRl mRNA level and the log PRL level had a linear regression. However, the correlation between the mRNA expression of ESR2 and sex, PRL level, tumor volume and tumor invasion in prolactionoms had no statistical significance. △5-Del-ESRl mRNAl levels in patients with PRL≥1 000 ng/ml were higher than those with PRLlt;1 000 ng/ml. The expression of D2RmRNA isomers was associated with biological behavior of pituitary adenomas. The expression of D2SmRNA be of significant differences in invasive and non-invasive PRL adenomas. D2SmRNA was expressed at low levels in invasive PRL adenomas.ConclusionThe expressions of ESRl, △5-Del-ESRl and D2R correlated with PRL secretion and tumor invasion in prolactionoms. However, the mechanism need for more researches.

Estrogen receptor; Dopamine receptor; 5th Exon deleted estrogen receptor type 1; Prolactionoms

1671-2897(2016)15-009-03

R 736.4

A

广东省医学科研基金资助项目(A2012725)

董家军，主任医师，博士后，E-mail: dongjiajun408@126.com

*通讯作者：董家军，主任医师，博士后，E-mail: dongjiajun408@126.com

2015-08-12；

2015-10-30)