尼古丁减轻高脂高果糖诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠的肝脏炎症

陈小梅，李富强，严 速，吴小翠，唐翠兰△

(1. 浙江中医药大学附属第二医院肝病科， 杭州 310005； 2. 温州医科大学附属第一医院腔镜外科， 浙江温州 325000)



·论著·

尼古丁减轻高脂高果糖诱导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠的肝脏炎症

陈小梅1，李富强1，严 速2，吴小翠1，唐翠兰1△

(1. 浙江中医药大学附属第二医院肝病科， 杭州 310005； 2. 温州医科大学附属第一医院腔镜外科， 浙江温州 325000)

目的：探讨活化胆碱能抗炎通路对非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)模型小鼠肝脏炎症的抑制作用及其分子机制。方法：60只雄性6周龄的无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级C57BL/6J小鼠被随机分为4组：正常饮食小鼠生理盐水注射组、正常饮食小鼠尼古丁注射组、NASH模型小鼠生理盐水注射组和NASH模型小鼠尼古丁注射组，分别给予普通饮食及高脂饮食加高果糖饮水，喂养17周后建立NASH小鼠模型，然后予各组小鼠生理盐水或尼古丁腹腔注射，每天1次，注射量为400 μg/kg，注射3周。3周后处死动物进行肝组织病理检查，取小鼠血清行酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测炎症因子白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)，同时原代分离培养肝巨噬细胞，使用Western blot和荧光共聚焦显微镜检测α7尼古丁型乙酰胆碱能受体(alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors，α7nAChR)、Toll样受体-4(Toll-like receptors-4，TLR-4)和磷酸化核转录因子-κB(nuclear factor κB of phosphorylation，p-NF-κB)的蛋白水平。结果：成功建立了NASH小鼠模型。给予小鼠尼古丁治疗后，小鼠肝组织病理结果显示，小鼠肝脏炎症和脂肪变性明显减轻；ELISA结果显示，小鼠血清中炎症因子IL-6、TNF-α水平下降；Western blot和荧光共聚焦显微镜结果显示，尼古丁治疗组小鼠α7nAChR蛋白水平上调，p-NF-κB水平下调。结论：活化胆碱能抗炎通路可以通过抑制NF-κB通路减轻NASH小鼠的肝脏炎症。

尼古丁；非酒精性脂肪性肝病；受体，胆碱能；炎症介导素类；小鼠

慢性炎症反应在非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)的发生、发展中起重要作用。NASH的炎症反应由多种细胞因子参与，如果能找到一种同时抑制多种炎症介质的治疗靶位，有效抑制炎症反应的发生、发展，将会在治疗NASH中发挥重要作用，有着巨大的潜在临床应用价值。胆碱能抗炎通路可以同时抑制多种炎症介质的产生，前期研究已经发现，体内外活化胆碱能抗炎通路可以减轻肥胖诱导的炎症和胰岛素抵抗[1]，如果能证实活化胆碱能抗炎通路能抑制NASH的肝脏炎症，将有重要的临床意义。因此，本研究通过模拟NASH患者高脂肪、高果糖的饮食习惯建立小鼠NASH模型[2]，进一步行尼古丁腹腔注射，系统地研究活化胆碱能抗炎通路对NASH小鼠肝脏炎症的抑制作用及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

果糖购于美国Amerisco公司，尼古丁和Ⅳ型胶原酶购于美国Sigma公司，Percoll液购于上海季美生物公司，异硫氰酸荧光素标记的α-银环蛇毒(fluorescein isothiocyanate α-bungarotoxin，FITC-αBGT)购于美国Sigma公司，小鼠肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)试剂盒购于深圳达科为公司。Toll样受体-4(Toll-like receptors-4，TLR-4)抗体购于美国Bioworld公司，α7尼古丁型乙酰胆碱能受体(alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors，α7n-AChR)抗体购于美国Proentech公司，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)抗体和磷酸化核转录因子-κB(nuclear factor κB of phosphorylation，p-NF-κB)抗体购自美国Cell Signal公司。

1.2 动物模型制备

无特定病原体(specific pathogen free，SPF)级雄性4周龄C57BL/6J小鼠共60只(购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司)，SPF级空调室内饲养，室温22～25 ℃，自由摄水和食物，适应饲养2周后，随机分为4组(随机数字表法)：正常饮食小鼠生理盐水注射组(n=15)、正常饮食小鼠尼古丁注射组(n=15)、NASH模型小鼠生理盐水注射组(n=15)和NASH模型小鼠尼古丁注射组(n=15)，分别予以普通饲料饮食加普通纯净水饮水和高脂饮食(高脂饲料：胆固醇1.5%、胆酸钠0.5%、奶粉5%、猪油10%、蛋黄粉5%、普通饲料78%)加高果糖饮水(30%果糖)。造模开始后每周测体重，观察动物的食欲、行为习惯、毛色等的改变，于7、11、17周分别在正常组和高脂组中取9只小鼠，剪尾采血检测谷草转氨酶(aspertate aminotransferase，AST)、谷丙转氨酶(alanine aminotranferease，ALT)， 同时于7和11周每组取2只小鼠、17周每组取6只小鼠处死，取肝组织做病理染色，评价造模情况。第17周小鼠造模成功后，分别予各组小鼠行生理盐水或尼古丁腹腔注射，尼古丁注射量为400 μg/kg，生理盐水注射量为对应尼古丁注射量的体积，每天1次，注射3周后，每组小鼠眼睛取血检测IL-6、TNF-α水平，然后全部处死(正常小鼠生理盐水注射组9只、正常小鼠尼古丁注射组8只、NASH小鼠生理盐水注射组9只和NASH小鼠尼古丁注射组10只)，称取肝脏湿重，统一取肝左叶做肝组织病理检测和免疫荧光，余肝组织裂解后提取蛋白做Western blot检测α7nAChR、TLR-4和p-NF-κB的蛋白水平。

1.3 组织学和血清学检测

分别于第7、11、17、20周予禁食16 h后处死小鼠，统一取肝左叶，采用冰冻切片进行油红O染色，观察肝细胞脂肪变性采用石蜡切片进行HE染色，观察肝组织炎症活动度。请两位以上不了解本研究的病理学专家参照NASH临床研究网络(NASH clinical research network，NASH-CRN)病理委员会提供的NASH活性评分系统(NAS)进行评分，包括脂肪变性(0～3)、小叶炎症(0～2)、肝细胞气球样变(0～2)，NAS评分总和(0～8)。同时于第7、11、17周每组取9只小鼠，剪尾采血于离心管中，室温静置30 min后离心取上清，使用日立7180生化分析仪检测小鼠血清AST、ALT。第20周所有小鼠完成腹腔注射后眼球取血，室温静置30 min后离心取上清，使用ELISA试剂盒检测各组小鼠血清中IL-6、TNF-α水平。

1.4 Western blot

将小鼠肝组织用磷酸盐缓冲液(phosphate buf-fer saline，PBS)洗净，置于离心管中，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎，每100 mg肝组织加入500 μL含苯甲基磺酰氟化物(phenylmethyl sulfonylfluoride，PMSF)的放射免疫沉淀测定(radio immunoprecipitation assay，RIPA)蛋白裂解液，于手动匀浆器上进行匀浆，1 min后置于冰上，3 min后再次匀浆并置于冰上，如此重复，裂解30 min后，在4 ℃下12 000×g离心15 min，取得的上清即为蛋白，将组织中提取的蛋白用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法测定细胞蛋白浓度后，加上样缓冲液后沸水煮8 min，迅速水浴冷却，取等量蛋白样品以10%(质量分数)SDS聚丙烯胺凝胶电泳分离，余下蛋白分装保存于-80 ℃冰箱待用。分离后的蛋白用电转移法转移到聚偏氟乙稀(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，转膜完成后用5%(质量分数)脱脂牛奶室温孵育封闭1 h，加入一抗于4 ℃孵育过夜，TBST缓冲液清洗3遍后加入二抗，室温孵育1 h，TBST清洗3遍，将PVDF膜平铺于暗盒中，取适量化学发光试剂(electrochemiluminescence，ECL)均匀滴于PVDF膜上，迅速盖上暗盒，在暗室内压片曝光显影,压片结果拍照分析保存。每份蛋白样品单独分析，每份蛋白样品重复3次试验。

1.5 荧光共聚焦显微镜检测小鼠肝组织中α7nAChR和p-NF-κB的表达

统一取小鼠肝右叶组织固定在甲醛溶液中24 h，脱水、透明、包埋、切片、贴片,制作石蜡切片，然后恒温箱中60 ℃烤片2 h，二甲苯、酒精脱蜡、水化，0.3%(体积分数)过氧化氢封闭内源性过氧化物酶，柠檬酸钠(0.01 mol/L，pH 6.0)隔水煮沸10 min修复抗原，3%(体积分数)牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)室温孵育封闭15 min，然后加入不带荧光的p-NF-κB抗体(1 ∶100)和带荧光的FITC-αBGT抗体(1 ∶100)4 ℃孵育过夜(α-BGT对α7nAChR具有高亲和力，能与α7nAChR形成专一性的、饱和的和不可逆性的结合，因此本实验通过FITC-αBGT检测α7nAChR，FITC-αBGT需避光孵育)。PBS缓冲液洗3次，孵育p-NF-κB抗体的切片需再加带荧光的二抗(1 ∶100)室温孵育1 h，PBS缓冲液洗3次，然后将所有切片加7-氨基放线菌素D(7-amino-actinomycin D，7-AAD，1 ∶100)染核45 min，PBS缓冲液洗3次，抗荧光猝灭剂封片，尽快在荧光共聚焦显微镜下观察。

1.6 统计学分析

2 结果

2.1 高脂高果糖饮食成功制备NASH小鼠模型

随着喂养时间的增加，普通饮食小鼠和高脂高果糖饮食小鼠体重均有增加，但高脂高果糖组小鼠体重增加趋势较普通饮食组小鼠明显(图1A)，于造模第17周，高脂高果糖组小鼠与正常组小鼠体重差异有统计学意义(P<0.01)。临床生物化学分析显示，高脂高果糖饮食的小鼠血清ALT水平在第7、11周时升高不明显，但在第17周时明显升高且与普通饮食小鼠差异有统计学意义(P<0.01，图1B);高脂高果糖饮食小鼠血清AST水平与普通饮食小鼠在第7、11、17周时差异均有统计学意义(P<0.01，图1C)。肉眼观察小鼠肝组织发现，高脂高果糖饮食小鼠肝脏膨胀，肝脏湿重明显高于普通饮食小鼠；HE染色和油红O染色显示，高脂高果糖饮食小鼠在第7周开始出现轻微炎症和脂肪变性，脂肪变性以小泡脂滴为主，到11、17周，炎症和脂肪变性逐渐加重，脂肪变性以中、大脂滴为主(图2)。NASH-CRN显示，高脂高果糖饮食小鼠得分随着喂养时间逐渐增高。

2.2 尼古丁治疗减轻NASH小鼠肝脏炎症

正常小鼠和NASH小鼠行3周腹腔注射后发现，生理盐水注射后的小鼠肝脏湿重没有明显变化，而尼古丁注射后的小鼠肝脏湿重与注射前相比明显减轻(图3A)。ELISA结果显示，与生理盐水注射相比，尼古丁注射能明显降低小鼠血清中IL-6和TNF-α水平(图3B、3C)。肝组织病理染色显示，尼古丁注射组肝脏炎症和脂肪变性与生理盐水注射组相比明显减轻(图4)。

2.3 尼古丁治疗减轻NASH小鼠肝脏炎症的分子机制

Western blot结果显示，尼古丁注射组较生理盐水注射组肝组织中α7nAChR蛋白表达水平上调，p-NF-κB蛋白表达水平下调，TLR-4表达水平无明显变化(图5)。另外，免疫荧光结果显示，加入FITC-αBGT抗体后，尼古丁注射组的荧光强度和密度高于生理盐水注射组，加入p-NF-κB抗体后，尼古丁注射组的荧光强度和密度低于生理盐水注射组(图6)。

ALT, amino transferase; AST, aspartic amino transferase; SC, standard chow; HFHF, high-fat and high-fructose. Data are expressed as ±s. *P<0.01, vs. SC.图1 高脂高果糖饮食对小鼠体重(A，n=30)、血清ALT(B，n=9)及AST(C，n=9)水平的影响Figure 1 Effects on body weight (A, n=30), serum levels of ALT (B, n=9) and AST (C, n=9) in mice with high-fat and high-fructose diet

SC, standard chow; HFHF, high-fat and high-fructose.

图2 高脂高果糖饮食诱导的NASH模型小鼠的病理表现(×20)
Figure 2 Pathologic manifestation of mice model of NASH induced by high-fat and high-fructose diet (×20)

TNF-α, tumour necrosis factor-α; IL-6, interleukin-6; SC, standard chow; NASH, non-alcoholic steatohepatitis; NT, nicotine; NS, saline. Data are expressed as ±s; *P<0.01, vs. before injection.图3 腹腔注射尼古丁3周后小鼠肝脏湿重(A)和血清中TNF-α(B)、IL-6(C)水平变化Figure 3 The change of liver weight (A), TNF-α (B) and IL-6(C) in mice after intraperitoneal injection for 3 weeks

图4 NASH模型小鼠腹腔注射后肝组织病理变化(×20)
Figure 4 The change of liver histopathological conditions after intraperitoneal injection for 3 weeks in NASH mice (×20)

NT, nicotine; NS, saline; NASH, non-alcoholic steatohepatitis; α7nAChR, alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors; TLR-4, Toll-like receptors-4; p-NF-κB, nuclear factor κB of phosphorylation. Data are expressed as ±s.*P<0.01, vs. NASH+NS.图5 腹腔注射后NASH小鼠肝组织中α7nAChR、TLR-4和p-NF-κB的蛋白表达水平Figure 5 The expression of α7nAChR, TLR-4, p-NF-κB protein after intraperitoneal injection in NASH mice

Abbreviations as in Figure 5.

图6 腹腔注射后NASH小鼠肝组织中α7nAChR、
p-NF-κB的免疫荧光图片
Figure 6 Immunohistochemistry of α7nAChR, p-NF-κB protein after intraperitoneal injection for 3 weeks in NASH mice

3 讨论

近来研究发现，在NASH的发病机制中存在肝的天然免疫功能紊乱，来源于肝巨噬细胞的炎症因子对NASH的发生、发展起重要作用[3]，巨噬细胞失活后可以阻断NASH大鼠肝脂肪变性和炎症的发展[4]。巨噬细胞的活化主要由肠道来源的内毒素脂多糖(lipopolysaccharides，LPS)启动[5]，LPS通过与巨噬细胞TLR-4结合，活化丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路和NF-κB[6]，导致细胞因子IL-6、TNF-α等产生[7]。IL-6、TNF-α在NASH发病机制中起重要作用，其中TNF-α不但可以引起肝细胞损伤，还可以导致胰岛素抵抗[8]。同时巨噬细胞也是参与胆碱能抗炎通路的主要靶细胞[9]，胆碱能抗炎通路主要通过活化巨噬细胞表面的α7nAChR发挥抗炎作用[10]。

本研究首先通过模拟NASH患者高脂肪、高果糖的饮食习惯建立小鼠NASH模型[2]。虽然目前还没有明确定义的NASH小鼠模型，但我们通过在实验过程中定期监测实验小鼠的体重，并对实验小鼠进行血清生化分析和肝组织病理检查，观察到随着高脂高果糖饮食喂养时间的延长，小鼠肝组织从单纯脂肪变性逐渐发展到脂肪性肝炎，血清AST和ALT水平逐渐增高，较为完整的呈现了人类NASH疾病的发生、发展过程。因此，此模型对于进一步研究NASH疾病发生、发展的分子机制研究具有重要意义。

其次,我们给予造模成功的C57BL NASH小鼠尼古丁腹腔注射3周后，发现NASH小鼠整体体重和肝脏湿重明显减轻，显微镜下肝组织病理染色发现NASH小鼠肝脏炎症程度下降，ELISA检测血清中TNF-α和IL-6水平下降,与前期实验中尼古丁减轻BALB/cNASH小鼠肝组织炎症程度，下调血清TNF-α水平，以及体外实验中尼古丁能抑制RAW264.7细胞产生TNF-α的结果一致[11]，并进一步观察到尼古丁对炎症因子IL-6水平的影响。

NF-κB是NASH中关键的前炎症信号途径，是免疫和炎症的主要调节因子，前期发现体外给予RAW264.7细胞尼古丁处理对NF-κB通路有抑制作用[11]。本研究进一步从体内实验观察到腹腔注射尼古丁能明显抑制小鼠肝Kupffer细胞上NF-κB的磷酸化，抑制NF-κB的转核，同时小鼠肝Kupffer细胞上的α7nAChR蛋白水平上调，但对模式受体TLR-4的表达影响不明显。另外，荧光共聚焦显微镜结果亦证实了尼古丁治疗可以上调α7nAChR蛋白水平，抑制NF-κB的转核。

本研究通过高脂饮食加高果糖饮水成功建立NASH小鼠模型，并通过体内实验观察到尼古丁通过上调α7nAChR激活胆碱能抗炎通路，抑制NF-κB通路的激活，减少炎症因子IL-6、TNF-α的释放，从而减轻小鼠的肝脏炎症，说明α7nAChR介导的抗炎信号传导通路与TLR-4介导的致炎信号传导通路均通过NF-κB信号通路调节，TLR-4介导的巨噬细胞活化在NASH的炎症反应中起重要作用[12]，而α7nAChR体内活化胆碱能抗炎通路对NASH炎症具有抗炎作用。

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(2014-12-29收稿)

(本文编辑：赵 波)

Nicotine alleviates the liver inflammation of non-alcoholic steatohepatitis induced by high-fat and high-fructose in mice

CHEN Xiao-mei1, LI Fu-qiang1, YAN Su2, WU Xiao-cui1, TANG Cui-lan1△

(1. Department of Liver Disease, The Second Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310005, China; 2. Department of Endoscopic Surgery, The First Affiliated Hospital of Whenzhou Medical University, Wenzhou 325000, Zhejiang, China)

Objective：To investigate the anti-inflammation effects by activation of the cholinergic anti-inflammatory pathway and its mechanisms in non-alcoholic steatohepatitis (NASH) model mice. Me-thods: 6-week-old male C57BL/6J (B6) mice were randomly divided into four groups: the first group was normal mice, injected with saline; the second group was normal mice, injected with nicotine; the third group was NASH model mice, injected with saline; the fourth group was NASH model mice, injected with nicotine. The experimental mice were fed with either standard chow (SC) or high-fat and high-fructose (HFHF) for 17 weeks to generate an NASH model mice. The mice received injection once daily for 3 weeks [nicotine dose, 400 μg/kg]. Then, their pathological characteristics and function of the liver were assessed. The expressions of interleukin-6 (IL-6) and tumor necrosis factor-α (TNF-α) in serum were analyzed by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). The expressions of alpha 7 nicotinic acetylcholine receptors (α7nAChR), Toll-like receptors-4 (TLR-4) and nuclear factor κB of phosphory-lation (p-NF-κB) in Kupffer cells were determined by Western blot and immunofluorescence assays. Results: We successfully generated NASH model mice by imitating the high-fat and high-fructose dietary style of NASH patients. The results of our investigation demonstrated that nicotine could reduce significantly the levels of IL-6, and TNF-α in serum (P<0.05). The expression of p-NF-κB protein in the group which was NASH model mice injected with nicotine declined significantly as compared with the group which was NASH model mice injected with saline (P<0.05). And the expression of α7nAChR protein elevated significantly conversely (P<0.05). Conclusion: Activation of the cholinergic anti-inflammatory pathway could inhibit the release of inflammatory factors as TNF-α and IL-6 in NASH model mice, and the mechanism for the inhibition of inflammatory was mediated by NF-κB pathway.

Nicotine; Non-alcoholic fatty liver disease; Receptors, cholinergic; Inflammation mediators; Mice

国家自然科学基金(81100279)和浙江省新苗人才计划项目(2014R410058)资助Supported by the National Natural Science Foundation of China (81100279) and Xin-miao Talent Program of Zhejiang Province (2014R410058)

时间：2016-6-29 14：22：18

http://www.cnki.net/kcms/detail/11.4691.R.20160629.1422.024.html

R575.1

A

1671-167X(2016)05-0777-06

10.3969/j.issn.1671-167X.2016.05.005

△Corresponding author’s e-mail, 1747603542@qq.com