延灵丹方对卵巢早衰小鼠激素水平及凋亡调控蛋白Bcl-2/Bax表达的影响

王 洋 王 滨 李鹏辉 郎尉雅

1.齐齐哈尔医学院生理教研室，黑龙江齐齐哈尔161006；2.齐齐哈尔医学院生物遗传教研室，黑龙江齐齐哈尔161006；3.齐齐哈尔医学院组胚教研室，黑龙江齐齐哈尔161006

延灵丹方对卵巢早衰小鼠激素水平及凋亡调控蛋白Bcl-2/Bax表达的影响

王 洋1王 滨1李鹏辉2郎尉雅3

1.齐齐哈尔医学院生理教研室，黑龙江齐齐哈尔161006；2.齐齐哈尔医学院生物遗传教研室，黑龙江齐齐哈尔161006；3.齐齐哈尔医学院组胚教研室，黑龙江齐齐哈尔161006

目的探讨延灵丹方对小鼠卵巢早衰（POF）模型激素水平及凋亡调节基因B细胞淋巴瘤/白血病-2原癌基因（Bc1-2）、Bc1-2相关X蛋白（Bax）表达的影响。方法将40只SPF级BALB/c雌性小鼠随机分为4组，包括空白组、模型组、延灵丹方组、西药组。除空白组外，其余各组建立免疫性POF小鼠模型。延灵丹方组给予延灵丹药液灌胃，西药组给予戊酸雌二醇灌胃，空白组、模型组给予等量生理盐水灌胃，各组均为2次/d，连续15 d。运用酶联免疫吸附测定实验检测小鼠血清雌二醇（E2）、卵泡刺激素（FSH）、促黄体生成素（LH）水平；Western b1ot法检测卵巢组织Bc1-2、Bax蛋白的表达。结果与空白组比较，模型组小鼠血清E2水平降低，血清FSH水平升高（P＜0.01），血清LH水平有一定程度升高（P＜0.05）；与模型组比较，延灵丹方组及西药组小鼠血清E2水平均升高，FSH、LH水平均降低（P＜0.01）。与空白组比较，模型组小鼠卵巢Bc1-2蛋白表达减少，Bax蛋白表达增加（P＜0.01），且Bc1-2/Bax下降（P＜0.01）；与模型组比较，延灵丹方组及西药组小鼠卵巢Bc1-2蛋白表达显著增加，Bax蛋白表达减少（P＜0.01），Bc1-2/Bax明显上升（P＜0.01）。结论延灵丹方通过下调卵泡及卵巢间质Bax蛋白的表达，上调Bc1-2蛋白的表达，抑制卵巢颗粒细胞的过度凋亡，调节卵巢激素水平，改善卵巢功能。

延灵丹方；卵巢早衰；性激素；Bcl-2；Bax；颗粒细胞；凋亡

月经初潮年龄正常或青春期延迟，第二性征发育正常的女性，在40岁之前闭经伴血清促性腺激素水平升高和雌激素水平下降则为卵巢早衰（premature ovarian fai1ure）。该病可出现围绝经期综合征症状、不孕症，增加罹患骨质疏松和抑郁症的风险，并可导致不同程度的认知功能障碍及神经系统疾病，近年来其发病率逐年上升［1-2］。研究发现，各种原因导致的卵巢早衰大都伴随着卵巢颗粒细胞的凋亡，因此卵巢颗粒细胞的凋亡可能成为卵巢早衰发病的始动因素［3-4］。中药复方制剂——延灵丹在治疗卵巢早衰排卵障碍和生殖内分泌紊乱方面取得了良好的临床疗效［5］。但是关于延灵丹对卵巢颗粒细胞凋亡的影响尚鲜见报道。本课题拟观察延灵丹方对卵巢早衰模型小鼠激素水平的调节及对卵巢颗粒细胞凋亡调控Bc1-2、Bax蛋白表达的影响，探讨延灵丹方对免疫性卵巢早衰模型小鼠的作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物

40只7～8周SPF级健康雌性BALB/c小鼠，由齐齐哈尔医学院动物实验中心提供［合格证号SCXK（黑）2015-0004］，饲养于齐齐哈尔医学院清洁级实验动物中心，室温维持在25℃，湿度60%～70%，通风良好。

1.2 试剂

中药饮片购自齐齐哈尔市中医医院中药局；戊酸雌二醇片购自德国拜耳医药有限公司，批号J20150012；小鼠透明带多肽溶液购自天津森润生物技术有限公司，批号P00102；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂购自上海伟进生物科技有限公司，批号F5884、F5502；小鼠血清雌二醇（E2）、小鼠促黄体生成激素（LH）和小鼠促卵泡生成激素（FSH）的酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒购自上海酶联生物有限公司，批号20150624。

1.3 仪器

MP-120-2型电子天平（上海第二天平仪器厂）；BX53光学显微镜（日本奥林帕斯公司）；RM2235冰冻切片机（德国Lecai公司）；Mu1tiskan MK3酶标仪（芬兰Thermo公司）。

1.4 药物配制

1.4.1 中药配制水煎地黄12 g、菟丝子12 g、杜仲12 g、山芋12 g、山药12 g、党参6 g、黄芪6 g、首乌6 g、黑蚁6 g、枸杞子6 g、牡蛎6 g、丹参6 g、香附6 g、甘草3 g，并浓缩至2倍临床等效剂量1.08 g/mL的无菌药液，4℃冰箱保存。

1.4.2 西药配制三蒸水溶解戊酸雌二醇片，浓度为0.006 mg/mL。

1.5 动物模型及实验分组

取6 mg ZP3透明多肽粉末，加入6 mL双蒸水配成溶液，与弗氏完全佐剂按1∶1配制成免疫试剂，与弗氏不完全佐剂按1∶1配成免疫强化试剂。每日上午9：00，每只小鼠给予0.15 mL免疫试剂注射双后脚掌处及腹腔皮下，14 d后以免疫强化试剂0.15 mL再次注射双后脚掌处及腹腔皮下加强免疫，建立免疫性卵巢早衰模型［6］。

将40只SPF级BALB/c雌性小鼠随机分为空白组、模型组、延灵丹方组、西药组，每组10只。除空白组外，其余各组建立免疫性卵巢早衰小鼠模型，空白组造模时每只小鼠予0.15 mL生理盐水注射双后脚掌及腹腔皮下。延灵丹方组给予2倍临床等效剂量（1.08 mL/20 g）延灵丹方药液灌胃，西药组给予0.4 mL/ 20 g戊酸雌二醇进行灌胃，空白组、模型组给予等量生理盐水进行灌胃。各组均为2次/d，连续15 d。

1.6 观察指标

1.6.1 小鼠脏器指数及卵巢组织形态学观察各组小鼠于灌胃结束后第2天，摘取眼球取血后处死，计算卵巢的脏器指数=脏器重量/体重。随后将1/2卵巢组织迅速用液氮保存用于Western b1ot等实验。另外1/2卵巢以4%多聚甲醛固定4～6 h，石蜡切片，HE染色，光学显微镜下观察。

1.6.2 血清学检测小鼠眼球取血，离心4000 r/min，10 min，分离血清，采用ELISA法，按照试剂盒使用说明操作检测血清中E2、FSH、LH的含量。

1.6.3 Western blot检测卵巢中Bcl-2尧Bax蛋白表达取每组小鼠卵巢组织20 g，冰上提取蛋白。BCA法测定蛋白浓度后确定蛋白上样量，进行SDS-PAGE凝胶电泳后，转至PVDF膜，以3%脱脂奶粉封闭1 h，再分别添加兔抗小鼠Bc1-2抗体（1∶500），兔抗小鼠Bax抗体（1∶100）和兔抗小鼠β-actin抗体（1∶300），37℃孵育2 h，洗膜后，加HRP标记的山羊抗兔IgG（1∶500），37℃孵育1 h。2 h后用超敏发光液显影、定影，Image-Pro P1us6.0.1软件测定各组蛋白条带吸光度值，以β-actin作为内参照，将各组条带与β-actin的比值作为蛋白表达水平。

1.7 统计学方法

采用SPSS 19.0统计软件对本实验数据进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组比较采用单因素方差分析，组间比较用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠卵巢大体解剖及染色光镜下组织形态观察

大体观察小鼠卵巢组织，空白组卵巢形态正常，颜色润泽；模型组小鼠双侧卵巢不同程度萎缩，色苍白。HE染色发现，空白组卵巢内见各级发育卵泡及其黄体组织，且卵母细胞体积较大，颗粒细胞数量多，闭锁卵泡较少；模型组卵巢内几乎不见成熟卵泡，闭锁卵泡数量增加，颗粒细胞数量明显减少。西药组和延灵丹方组卵巢组织间质少，黄体较多，可见大量原始卵泡和初级卵泡、次级卵泡及接近成熟的卵泡，颗粒细胞数量较模型组增多。见图1。

图1 各组小鼠卵巢组织形态学病理切片（HE染色，100×）

2.2 各组小鼠血清性激素水平及脏器指数变化情况

与空白组比较，模型组小鼠血清E2水平降低，血清FSH水平升高，差异有高度统计学意义（P＜0.01），血清LH水平有一定程度升高，差异有统计学意义（P＜0.05），提示造模成功；与模型组比较，西药组、延灵丹方组小鼠血清E2水平有所上升，FSH、LH水平均有所下降，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。与空白组比较，模型组的卵巢指数显著降低（P＜0.01），提示小鼠卵巢萎缩；与模型组比较，西药组及延灵丹方组卵巢指数有所上升（P＜0.05），提示药物使小鼠卵巢质量得到改善。见表1。

表1 各组小鼠血清E2、FSH、LH含量测定及卵巢指数比较（，n=10）

表1 各组小鼠血清E2、FSH、LH含量测定及卵巢指数比较（，n=10）

注：与空白组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；E2：雌二醇；FSH：卵泡刺激素；LH：促黄体生成素

组别卵巢指数E2（Pg/mL）FSH（mU/mL）LH（mU/mL）空白组模型组西药组延灵丹方组F值P值0.081±0.011 0.052±0.007**0.064±0.013#0.066±0.012#10.85＜0.01 119.60±21.60 61.20±10.35**96.45±20.78##104.11±20.96##16.91＜0.01 3.89±1.43 5.82±1.08**4.20±0.85##3.90±1.19##6.37＜0.01 3.85±1.11 5.52±1.08*4.14±1.06##3.93±1.01##5.40＜0.01

2.3 各组小鼠卵巢Bcl-2、Bax蛋白的表达

与空白组比较，模型组小鼠卵巢组织Bc1-2蛋白表达减少，而Bax蛋白表达增加（P＜0.01），且模型组小鼠卵巢Bc1-2/Bax显著下降，差异有高度统计学意义（P＜0.01）；提示卵巢Bax蛋白上调，Bc1-2蛋白下调可能加速卵巢颗粒细胞凋亡，导致卵泡闭锁，发生卵巢早衰。与模型组比较，延灵丹方组及西药组小鼠卵巢Bc1-2蛋白表达显著增加，Bax蛋白表达减少（P＜0.01），且Bc1-2/Bax明显上升，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表2、图2～3。

表2 各组小鼠卵巢Bcl-2、Bax蛋白的表达（，n=10）

表2 各组小鼠卵巢Bcl-2、Bax蛋白的表达（，n=10）

注：与空白组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

组别Bc1-2BaxBc1-2/Bax空白组模型组西药组延灵丹方组F值P值0.46±0.01 0.30±0.02**0.43±0.02##0.44±0.03##117.59＜0.01 0.27±0.02 0.47±0.01**0.29±0.03##0.30±0.03##148.84＜0.01 1.78±0.23 0.61±0.09**1.69±0.07##1.63±0.10##136.12＜0.01

图2 小鼠卵巢Bcl-2蛋白的表达

图3 小鼠卵巢Bax蛋白的表达

3 讨论

祖国医学认为卵巢早衰属“闭经”“血枯”“不孕症”“血隔”的范畴。中医学卵巢早衰病因病机主要是肾阴亏虚［7］，延灵丹方以补肾填精、养血益气、调理冲任为立方大法。方中用地黄、菟丝子、山芋、山药、杜仲、首乌、枸杞子养阴生水填精，为方中主药。地黄可“补肾水真阴不足”；菟丝子为治疗女子肾精亏虚的要药；枸杞能“补肝经之阴，益肾水之阳”，所谓补阴稍佐以补阳之药，阳中求阴；首乌与诸药相配，固涩精气，使肾气得固，精有所藏。在补肾填精的同时，方中又以黑蚁、丹参、党参、黄芪等养血益气；香附养气以行血；牡蛎“为肝肾血分之要药”［8-9］。纵观全方配伍，以补肾滋水为主，使精足而天癸充盛，再养血行气使精充血足，经血有其物质基础，营血充盛，阴可制阳，五志七情调畅，诸证可解。

女性的卵母细胞储备数量从出生开始就已确定，在女性整个生命周期中只有400～500个卵泡可发育成熟并排卵［10］。在早期卵泡闭锁过程中，卵母细胞首先开始凋亡，卵泡细胞颗粒由内层向外层逐渐凋亡；而对于生长晚期的卵泡，则是颗粒细胞首先凋亡，诱导卵母细胞凋亡，触发卵泡闭锁［11-12］。卵巢的颗粒细胞分泌的雌激素对维持女性生理活动有重要作用，故颗粒细胞凋亡诱发卵巢早衰，已成为目前公认的首要发病因素。凋亡是由相关性基因调控完成的细胞主动性死亡的过程，众多研究认为，对卵巢颗粒细胞凋亡起主要作用的基因有Bc1-2、Bax。Bc1-2是人体的长寿基因之一，也是目前研究较多的一种抑制细胞凋亡的基因［13］。Bc1-2基因可抑制颗粒细胞凋亡，促进其分裂，降低卵泡的闭锁率［14］；若卵巢中缺少Bc1-2基因，则有效卵泡减少，乃至出现无卵母细胞的卵泡［15］。Bax基因与Bc1-2基因同源且相互拮抗，研究显示Bax蛋白过度表达是卵子细胞死亡的关键因素［16］。若Bc1-2＜Bax，则细胞趋向凋亡；若Bc1-2＞Bax，则细胞趋向成活［17-18］。

透明带抗原免疫可使卵巢闭锁卵泡增加，局部免疫调节功能紊乱，导致颗粒细胞凋亡加速，分泌雌激素能力下降，发生卵巢功能早衰［19-20］。本研究在通过透明带多抗为免疫原建立卵巢早衰模型小鼠基础上，观察中药复方延灵丹对卵巢早衰模型小鼠血清激素水平的影响，证实了延灵丹方的治疗效果；进一步观察结果显示，延灵丹方和戊酸雌二酮均能够上调Bc1-2蛋白表达水平，下调Bax蛋白表达水平，进而使Bc1-2/ Bax比例升高，抑制卵巢颗粒细胞的过度凋亡，减少卵泡闭锁，改善卵巢功能，促进卵巢早衰的逆转。由于中药复方制剂属于多靶点药物，是否存在其他作用机制，在今后的研究中需进一步探索。

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Influence of Yanlingdan PrescriPtion on the levels of sex hormone and ex-Pression of aPoPtosis adjusted Protein Bcl-2/Bax in mice with Premature ovarian failure

WANG Yang1WANG Bin1LI Penghui2LANG Weiya3
1.Staff Room of Physio1ogy，Qiqihar Medica1 University，Hei1ongjiang Province，Qiqihar161006，China；2.Staff Room of Biogenetics，Qiqihar Medica1 University，Hei1ongjiang Province，Qiqihar161006，China；3.Staff Room of Histoembryo1ogy，Qiqihar Medica1 University，Hei1ongjiang Province，Qiqihar161006，China

Objective To investigate the effect of Yan1ingdan Prescription on the 1eve1s of sex hormone and expression of B-ce11 1ymphoma/1eukemia-2（Bc1-2）and Bc1-2 associated X protein（Bax）in mice mode1 with premature ovarian fai1ure（POF）.Methods Forty SPF BALB/c fema1e mice were random1y divided into b1ank group，mode1 group，Yan-1ingdan Prescription group and western medicine group.Autoimmune POF mice mode1 were set up except b1ank group. Yan1ingdan Prescription group was given Yan1ingdan Prescription by gavage，western medicine group was given estradio1 va1erate by gavage，b1ank group and mode1 group were given equiva1ent norma1 sa1ine by gavage，twice a day for 15 days.The serum 1eve1s of estradio1（E2），fo11ic1e-stimu1ating（FSH），1utropin（LH）were detected by the enzyme-1inked immunosorbent assay（ELISA）method.The expression of Bc1-2 and Bax protein in mice ovarian tissue was detected by Western b1ot method.Results Compared with the b1ank group，the serum 1eve1 of E2was decreased，FSH was increased in mode1 group，with high1y statistica11y significant differences（P＜0.01），meanwhi1e，the 1eve1 of LH was increased to a certain extent，with statistica11y significant difference（P＜0.05）；compared with the mode1 group，the serum 1eve1s of E2in western medicine group and Yan1ingdan Prescription group were increased，the 1eve1s of FSH and LH were decreased significant1y（P＜0.01）.Compared with the b1ank group，the expression of Bc1-2 protein in mode1 group was decreased significant1y，and the expression of Bax protein was increased significant1y（P＜0.01），and Bc1-2/ Bax ratio of mode1 group was decreased significant1y（P＜0.01）；compared with the mode1 group，the expression ofBc1-2 protein in Yan1ingdan Prescription group and western medicine group were increased obvious1y，the expression of Bax protein were decreased（P＜0.01），and the Bc1-2/Bax ratio was increased significant1y（P＜0.01）.Conclusion Through down-regu1ating the expression of Bax in fo11ic1e and ovarian stroma and up-regu1ating the expression of Bc1-2，Yan-1ingdan Prescription can inhibit the excessive apoptosis of granu1ar ce11s，regu1ate the sex hormone 1eve1s，and improve the function of ovaries.

Yan1ingdan Prescription；Premature ovarian fai1ure；Sex hormone；Bc1-2；Bax；Granu1ar ce11；Apoptosis

R711.75

A

1673-7210（2016）07（c）-0042-04

2016-03-25本文编辑：张瑜杰）

黑龙江省齐齐哈尔市科学技术计划项目（SFGG-201510、SFGG-201565）。

王洋（1983.8-），女，硕士研究生；研究方向：生殖与内分泌。