利用反向遗传技术构建表达绿色荧光蛋白的H9N2禽流感重组病毒

崔宏锐，滕巧泱，石　迎，陈鸿军，李雪松，刘芹防，李泽君

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

利用反向遗传技术构建表达绿色荧光蛋白的H9N2禽流感重组病毒

崔宏锐，滕巧泱，石迎，陈鸿军，李雪松，刘芹防，李泽君

（中国农业科学院上海兽医研究所，上海 200241）

H9N2 亚型禽流感病毒普遍存在于我国大部分地区，宿主范围较广，是世界卫生组织发布的最具大流行潜力的病毒之一。为了利用H9N2亚型禽流感病毒表达绿色荧光蛋白（green fl uorescent protein，GFP），通过反向遗传操作技术将A/Chicken/ Shanghai/2093/2009（H9N2）（SH2093）毒株的NS2基因连接到PB1基因下游，同时将GFP基因连接在NS1基因之后，拯救并获得了 1 株表达GFP的重组病毒SH2093-GFP。虽然SH2093-GFP 在MDCK细胞上的增殖能力低于野生毒株 SH2093，但该病毒可以成功表达GFP，为进一步研究H9N2亚型禽流感病毒作为外源基因表达载体等提供重要依据。

禽流感病毒；H9N2 亚型；反向遗传操作；基因重组病毒

自1994年我国首次报道从鸡群分离到H9N2亚型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）以来，该亚型流感病毒开始广泛存在于辽宁省、安徽省、山东省、广东省、福建省、江苏省、河南省、湖南省、上海市、广西壮族自治区、云南省、四川省等全国大部分地区[1-3]，成为危害我国养殖业的最主要的低致病性禽流感病毒[4]。目前，H9N2亚型禽流感病毒感染禽类后还没有出现大批死亡的现象，但可导致禽类产蛋量下降，出现免疫抑制病，并可与其他病原体共同感染从而导致高死亡率。同时H9N2亚型AIV传播能力特别强，存在范围极其广泛，该病毒还可感染猪[2]和人[5,6]。有研究表明，2013～2014年间多次爆发于我国内地多个省市，造成人感染和死亡的H7N9亚型AIV中，有6个内部基因源于H9N2亚型AIV[7,8]。不仅如此，H9N2亚型AIV与其他亚型流感病毒共感染时很容易发生基因重组，产生能够引起人畜共感染的新型病毒亚型[9]，如1997年爆发的H5N1亚型流感病毒[10]和近些年频发的H7N9[11]和H10N8亚型流感病毒[12]。因此，H9N2亚型禽AIV已对我国养禽业和人类健康造成潜在威胁，也是亟待于研究的病毒之一。

新型病毒载体已经广泛应用于跟踪报告基因和生物活性分子，在基因治疗和感染性疾病领域发挥重要作用。由于分节段负链RNA病毒反向遗传技术的发展，A型流感病毒（AIV）也被视为潜在的疫苗和治疗载体[13,14]。Pena 等[15]成功构建出用于表达多种外源基因（eGFP、GLuc、HA等）重组H9N2亚型AIV，并将该方法应用于研究新型流感疫苗。不仅如此，在A型流感病毒基因组中插入并成功表达外源基因的方法还可以进一步应用于流感病毒聚合酶表达效率、病毒基础变异速率等方面研究。

本研究以实验室保存的A/chicken/S h a n g h a i/ 2093/2009(H9N2）（SH2093）毒株为亲本，构建并拯救能够表达GFP的禽流感重组病毒，为进一步研究H9N2亚型禽流感病的变异速率等提供材料。

1　材料和方法

1.1主要材料RNA提取试剂盒、去内毒素小量抽提质粒试剂盒购自QIAGEN公司；M-MLV反转录酶、Ribonuclease inhibitor、10 mmol/L dNTP mix、DH5α感受态细胞购自北京全式金公司；BspQΙ限制性内切酶、T4 DNA连接酶购自New England Biolab公司；胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒购自 Axygen 公司；PCR mix 购自东盛生物公司；DMEM培养基、胎牛血清（FBS）购自Gibco公司；Opti-MEM 购自Life technology公司；TransIT®-293 Transfection Reagent 购自Mirus Bio LLC公司；TPCK胰酶购自Sigma公司。

1.2病毒和细胞A/Chicken/Shanghai/2093/2009（H9N2）（简称为SH2093）病毒株、病毒SH2093/ H9N2反向遗传操作系统（包括pBD-PB2、pBDPB1、pBD-PA、pBD-HA、pBD-NP、pBD-NA、pBD-M、pBD-NS）、pBD载体、pBD-GFP质粒、293T细胞和MDCK细胞由本实验室提供。

1.3分子生物学分析软件LaserGene 7 版本软件包：EditSeq、MegAlign、SeqMan 、PrimerSelect等软件。

1.4引物设计参照实验室前期工作测得的SH2093毒株、GFP的基因序列，使用Primer premier 5.0软件设计各片段扩增所需的引物，待融合的相邻基因片段在相应的引物上设计有至少15～25 nt的核苷酸重叠区域，如表1。其中，PB1基因和NS基因的首尾引物均添加Sap I 酶切位点，便于将基因连接到具有相同酶切位点的pBD 载体上。根据截短后的口蹄疫病毒（Foot and mouth disease virus，FMDV）的顺式作用水解酶元件（CHYSEL）核苷酸序列（后文简称FMDV-2A）信息（5′-CTTCTGAACTTCGACCTCC TCAAGTTGGCGGGTGACGTTGAGTCCAACCCCG GGCCC- 3′），将此2A片段拆分加入到PB1、NS1片段的下游引物和GFP、NS2片段的上游引物中。

1.5重组质粒pBD-PB1-NS2和 pBD-NS1-GFP的构建参考文献[15]介绍的构建方案，以本实验室分离保存的SH2093病毒（A/Chicken/Shanghai/2093/2009（H9N2））为亲本， 将NS基因上表达NS2（NS2）蛋白的ORF区域用手足口病病毒（FMDV）2A 顺式作用水解酶元件（CHYSEL）（以下简称2A）连接在PB1基因的ORF后；将GFP荧光蛋白的核苷酸序列通过2A蛋白编码序列连接在NS1基因的ORF之后，并且分别保留两个基因节段的包装信号（图1）。将改造后的PB1-NS2基因节段和NS1-GFP基因节段分别插入到pBD双向表达质粒载体上，利用这两种质粒与其他6个转录流感病毒RNA的pBD质粒共转染293T细胞，拯救表达GFP的H9N2重组病毒。以已有的SH2093病毒反向遗传系统中的pBD-PB1质粒为模板，分别以引物对SapI-PB1-1F、PB1-2A-R和引物对PB1-2743F、Sap I-PB1-2284R扩增出PB1的ORF片段和PB1基因的3′端包装信号PB1-3′Packing signal；同理扩增出NS1片段和NS基因3′ 端包装信号NS1-3′Packing signal。使用引物对Sap I-PB1-1F、NS2-R将片段PB1和NS2进行融合PCR扩增出PB1-2A-NS2片段，然后以此片段和PB1-3′Packing signal包装信号进行融合，得到完整的带有PB1基因包装信号和Sap I酶切位点的PB1-NS2全长片段。同样，扩增出NS1-GFP全长片段。扩增出的全长片段用1%琼脂糖电泳鉴定。PCR产物经割胶纯化后，用Sap I的同工酶（BspQ I酶）进行酶切切，并连接于具有相同酶切位点的pBD载体中。构建的重组质粒经PCR鉴定并测序。测序正确的质粒使用去内毒素小量抽提质粒试剂盒提取质粒，分装保存于-20 ℃备用。

表1　各片段PCR扩增引物Table 1　Primers for every fragment

图1　PB1和NS基因结构示意图Fig. 1　Recombinant gene of PB1 and NS

1.6转染利用TransIT®-293 Transfection Reagent将构建的质粒pBD-PB1-NS2和pBD-NS1-GFP，以及SH2093病毒的其余6个基因的重组质粒pBD-PB2、pBD-PA、pBD-HA、pBD-NP、pBD-NA和pBD-M共转染生长密度为90%～95%的293T细胞。转染后6 h，弃去细胞上清，加入1 mL新鲜的OPTI-MEM培养液，于37℃、CO2培养箱中培养48 h。

1.7病毒的拯救转染48 h 后的细胞上清中加入2 μL TPCK胰酶（0.5 mg/mL），于37℃、CO2培养箱中作用1～2 h后，将细胞上清接种9～11日龄SPF 鸡胚，置于37℃孵化器内培养48 h，收获鸡胚尿囊液。通过血凝试验测定尿囊液凝集红细胞能力，收集有血凝活性的尿囊液，分装并冻存于-80℃，命名为重组病毒SH2093-GFP株。

使用RNA提取试剂盒，提取重组病毒SH2093-GFP的总RNA，使用流感通用反转录引物12 bp将病毒RNA进行反转录获得cDNA第一链，以此cDNA为模板，分别用SapI-PB1-1F、SapI-PB1-2480R和引物对SapI-NS-1F、SapI-NS-890R为上下游引物（见表1）和流感病毒基因通用引物[16]，Pfx DNA Polymerase进行PCR，扩增重组病毒PB1-NS2、NS1-GFP基因和HA、NA、M基因，并送金唯智生物公司进行基因序列的测定。

同时，SH2 093-GFP病毒稀释1000倍后接种于长至80%的MDCK细胞六孔板中，使用2 mL含有TPCK胰酶的无血清 DMEM培养基于37℃孵化器内培养24 h后观察细胞质中是否有荧光表达，以进一步确认SH2093-GFP病毒能够稳定表达GFP。

1.8病毒滴度的测定将病毒液按10倍梯度稀释，将不同稀释度的SH2093-GFP病毒感染96孔板中密度长至80%的MDCK细胞，每孔加入100 μL病毒，每个稀释度做8个重复，吸附了病毒的细胞在CO2培养箱继续培养72 h，观察细胞病变和细胞的荧光情况，利用Reed-Muench法计算TCID50。

1.9SH2093-GFP病毒在MDCK细胞上生长曲线的绘制将SH2093-GFP病毒和亲本病毒SH2093毒株以0.1 MOI分别感染六孔板中长至80%的MDCK细胞，吸附1 h后，换入含有TPCK-Trypsin的无血清 DMEM培养液，接毒12、24、36、48、60、72 h后，分别收集其细胞上清200 μL并补液200 μL，测定血凝效价，每份样品重复3次，比较SH2093-GFP病毒和亲本病毒SH2093毒株在MDCK细胞上的生长情况。

2　结果

2.1重组质粒pBD-PB1-NS2和 pBD-NS1-GFP的鉴定分别用引物对SapI-PB1-1F、SapI-PB1-2480R和引物对SapI-NS-1F、SapI-NS-890R，PCR 方法扩增PB1-NS2和NS1-GFP全片段，1%琼脂糖电泳检测。分别扩增出大小为2783 bp（图2A）和1630 bp（图2B）的特异目的条带，与预期条带大小一致。此外，以pBD-up、pBD-down为上下游引物，再分别以PB1-2A-R、NS2-2A-F和2A-GFP-F为中间引物进行测序，测序结果表明序列与预期结果一致。

2.2重组病毒SH2093-GFP病毒的鉴定经血凝实验测定，拯救重组病毒SH2093-GFP的血凝效价为28。收获尿囊液，分装并保存于-80℃冰箱备用。此外，取尿囊液提取病毒总RNA，经RT-PCR扩增PB1-NS2、NS1-GFP基因。拯救HA、NA和M基因，并回收PCR产物测序。测序结果显示，拯救病毒SH2093-GFP株的PB1-NS2、NS1-GFP、HA、NA和M序列与亲本病毒SH2093序列完全一致。

SH2093-GFP病毒株稀释后接种MDCK细胞，于37℃孵化器内培养24 h后使用荧光显微镜观察细胞，发现全部细胞核和细胞质中充满绿色荧光，部分细胞已经发生形态改变，少数细胞皱缩变圆发生脱落（图3）。

图2　重组质粒pBD-PB1-NS2和 pBD-NS1-GFP的PCR鉴定Fig. 2　Identifi cation of recombinant plasmids pBD-PB1-NS2 and pBD-NS1-GFP by PCR

图3　SH2093-GFP病毒株感染MDCK细胞后的细胞病变Fig. 3　Cytopathic effect in MDCK cells infected with H9N2-SH2093-GFP

2.3SH2093-GFP病毒株滴度显微镜下观察96孔板中感染病毒72 h后MDCK细胞的病变和荧光情况。观察到有1个细胞质中有明显荧光的MDCK细胞，即认定该细胞孔为阳性，没有明显荧光的细胞孔为阴性。如此计数每个稀释度的8个重复中的阳性个数，使用Reed-Muench法计算获得SH2093-GFP病毒株滴度为1×105.5TCID50/100 μL。

2.4SH2093-GFP病毒株在MDCK细胞上的生长曲线按0.1MOI感染量分别感染重组病毒SH2093-GFP和亲本病毒 SH2093毒株。SH2093-GFP株病毒感染后12 h血凝价没有明显升高，48 h达到生长曲线顶峰，血凝效价达到24，此后迅速下降，72 h时血凝效价基本回落到12 h 时的水平。而亲本病毒SH2093毒株在感染后24 h效价便达到24，在48 h最高峰时的效价达到27，此后72 h虽有所下降但基本维持在这个水平（图4）。

SH2093-GFP病毒株血凝效价上升趋势与亲本病毒SH2093毒株趋于一致，48 h达到峰值24后便开始下降，但总体血凝效价较低。

图4　SH2093-GFP株和亲本SH2093病毒株感染 MDCK细胞后不同时间的血凝效价Fig. 4　Hemagglutination titer of the supernatant of MDCK cells infected with recombinant infl uenza virus (SH2093-GFP) and wild-type SH2093 infl uenza virus at different hours post-infection

3　讨论

本研究中，我们参考了Troy Sutto[15]介绍的构建方案，以本实验室分离保存的SH2093病毒（A/ Chicken/Shanghai/2093/2009（H9N2））为背景，将NS基因上表达NS2（NS2）蛋白的ORF区域用FMDV-2A连接在PB1基因的ORF后；将GFP荧光蛋白的核苷酸序列通过FMDV-2A蛋白编码序列连接在N S1基因的ORF之后，并且分别保留两个基因节段的包装信号，以保证插入外源基因后的重组基因序列的顺利包装表达[17]。反向遗传操作技术在国内的发展已经相当成熟，为从分子水平研究流感病毒致病性、种间传播能力、病毒变异机制提供了良好的平台和基础。本实验室已经成功建立了H9N2亚型禽流感病毒SH441毒株的反向遗传系统[18]，为本研究的顺利进行提供参考和依据。

本研究结果表明，拯救得到的SH2093-GFP株能够顺利表达GFP，但是在MDCK细胞上的复制能力不及亲本病毒SH2093株。这是由于H9N2亚型禽流感病毒自身的致病性和复制能力不高，再加上对病毒复制能力和致病性有影响的PB1基因和NS基因进行了基因截断和插入的生物学操作，可能会对病毒的复制能力产生影响。Sutto等[15]对NS1蛋白C端进行截短，保留NS1肽链的1～99个氨基酸。本研究为了尽量减少对SH2093亲本毒株基因上的改变，保留了NS1蛋白的完整性，没有对其进行截短。Li等[19]以A/ PR/8/34 （PR8）为亲本比较了外源基因（eGFP）插入到NS基因5′端和3′端的差异，结果表明，将外源基因插入到3′端时蛋白的表达比较分散，会在细胞核和细胞膜上同时表达，与本研究观察到的结果一致。本研究中拯救获得的重组病毒可以在后续的体内、体外实验中使用，且这种基因重组构建方法可以尝试应用于其他亚型流感病毒。由于不同亚型流感病毒的致病性差异较大，且相关基因重组的操作会不同程度影响重组病毒的致病性。因此，此方法应用于其他研究前需要对病毒的致病性等特性进行确认。

总之，本研究以SH2093毒株为亲本，参考相关文献报道，成功插入并表达外源基因GFP，得到的SH2093-GFP病毒株的滴度达到1×105.5TCID50/100 μL，可以进一步应用于体内和体外试验。病毒株为实验室后期进一步研究禽流感病毒变异、其他外源基因的表达和病毒载体在治疗和免疫方面的应用提供了平台和基础。

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GENERATION OF A RECOMBINANT H9N2 INFLUENZA VIRUS EXPRESSING GFP BY REVERSE GENETIC MANIPULATION

CUI Hong-rui, TENG Qiao-yang, SHI Ying, CHEN Hong-jun, LI Xue-song, LIU Qin-fang, LI Ze-jun
(Shanghai Veterinary Research Institute, CAAS, Shanghai 200241, China)

The H9N2 Avian infl uenza virus (AIV) circulating in most parts of China with a wide host range, has been on the list of World Health Organization for the greatest pandemic potential. To obtain a H9N2 AIV expressing enhanced green-fl uorescent protein (GFP), reverse genetics system was used to manipulate the AIV strain A/Chicken/Shanghai/2093/2009 (H9N2) (SH2093) in order to develop the recombinant virus (SH2093-GFP). Rearrangement of the infl uenza genome was accomplished by inserting the NS2 gene downstream of the PB1 gene to express NEP protein and GFP gene downstream of a full-length NS1 gene. The recombinant virus SH2093-GFP expressed GFP on MDCK cells successfully though its replication was not effi cient as compared with its parental virus SH2093, suggesting that the H9N2 AIV might be a promising vector candidate for expression of other exogenic proteins.

Avian infl uenza virus; H9N2 subtype; reverse genetics; recombinant virus

S852.659.5

A

1674-6422（2016）03-0006-06

2015-12-18

国家自然基金（31472206）

崔宏锐，女，硕士研究生，预防兽医学专业

李泽君，E-mail：lizejun@shvri.ac.cn