重症监护病房医院感染耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌耐药基因的研究与分析

陈　璐，李凌竹，冷应蓉，查筑红，程永素，黄　冰，罗光英，王　敏，江银辉（贵州医科大学附属医院感染管理科，贵州贵阳 550004）

重症监护病房医院感染耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌耐药基因的研究与分析

陈璐，李凌竹，冷应蓉，查筑红，程永素，黄冰，罗光英，王敏，江银辉（贵州医科大学附属医院感染管理科，贵州贵阳 550004）

目的：通过分析菌株耐药性和耐药基因检出情况，了解我院医院感染耐碳青霉烯鲍曼不动杆菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）的流行病学特点，并探讨耐药机制，为临床合理选药提供参考。方法：筛选重症监护病房医院感染患者送检标本分离的CRAB，采用PCR扩增技术检测菌株是否携带OXA-23、TEM、SHV、VEB、CARB、DHA、VIM、IMP、PER、aac(3)-I、aac(6')-Ib、aph(3')-I、armA、sul1和sul2基因。结果：53株医院感染CRAB对复方新诺明、妥布霉素较敏感，对其余13种抗菌药物耐药率均达50%以上，基因检出率依次为：TEM 100%，OXA-23 96.23%，armA 90.57%，aac(6')-Ib 22.64%，aac(3)-I 26.42%，aph(3')-I 73.58%，sul1 30.19%，sul2 56.60%，SHV 3.77%，VEB、CARB、DHA、IMP、VIM、PER未检出。共14组耐药基因检出与耐药情况完全相同的菌株。结论：我院医院感染CRAB的患者仍可考虑选用复方新诺明和妥布霉素进行治疗。我院定居并繁殖的CRAB耐β-内酰胺类抗菌药物的机制可能与TEM酶密切相关，携带OXA-23基因可能是耐碳青霉烯类抗菌药物的重要因素，检出率低的耐药基因可能在耐β-内酰胺类抗菌药物机制中的作用不大。我院不仅存在科室内部的交叉感染，而且存在科室之间的交叉感染，应加大力度做好感染控制工作。

耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌；耐药；耐药基因；医院感染

鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）已成为我国院内感染的主要致病菌之一，2014年中国CHINET细菌耐药性监测网数据显示，我国17所教学医院鲍曼不动杆菌占临床分离革兰阴性菌的14.23%，仅次于大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌[1]。广谱抗菌药物的大量运用使鲍曼不动杆菌耐药形势严峻，耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌（carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii，CRAB）的比例逐年增高，细菌对碳青霉烯类耐药即意味着对其他抗菌药物基本耐药[2]。重症监护病房收治的患者免疫力低下、侵入性操作多，并长期使用各类广谱抗菌药物，感染CRAB的患者较多见。本研究重点考察重症监护病房医院感染患者所分离CRAB的耐药性，初步了解我院医院感染CRAB的流行病学特点，并探讨耐药性与耐药基因的关联性，以期为分子生物学研究及临床合理用药提供理论参考。

1　材料和方法

1.1菌株来源

53株CRAB分离源自2014年1月– 2015年5月贵州医科大学附属医院重症监护病房（ICU）医院感染患者不同来源的标本（剔除同一患者同部位的重复标本）。医院感染判断标准遵循《医院感染诊断标准》并结合临床实际情况。

1.2细菌分离鉴定及药敏试验

采用美国德灵Microscan WalkAway 4.0系统对病原菌进行鉴定及药敏试验。质控菌株标准菌株PAE ATCC 27853购自贵州省临床检验中心。药敏纸片购自英国Oxoid公司。检测菌株对阿米卡星、头孢他啶、环丙沙星、头孢曲松、头孢噻肟、头孢吡肟、庆大霉素、左氧氟沙星、美罗培南、哌拉西林、头孢哌酮/舒巴坦、复方新诺明、替卡西林/克拉维酸、四环素、妥布霉素的敏感性。结果判定依据临床实验室标准化协会（CLSI）制定的标准。

1.3细菌处理

挑纯培养菌，取1 mL细菌LB培养液于1.5 mL离心管内，离心（12 000 r·min-1）1 min去上清，用1 mL无菌蒸馏水重新悬浮细菌沉淀，离心（12 000 r·min-1）1 min去上清，加蛋白酶K（200 ng·mL-1）溶液500 μL，56 ℃水浴2 h，然后于沸水中水浴10 min，离心（12 000 r·min-1）1 min，取上清液即为基因检测的模板液，于– 20 ℃冰箱保存备用。

1.4基因检测

采用PCR法检测15个耐药基因，PCR仪为ABI2700型。引物序列根据数据库NCBI（www.ncbi. nlm.nih.gov/nucleotide）各基因序列完成设计，靶基因序列登录号、引物序列及目的产物长度见表1。各反应体系为20 μL：上下游引物各l μL（10 μmol·L-1），dNTP 2 μL （2 mmol·L-1），10倍PCR缓冲液（含Mg2+）2 μL，TaqDNA 聚合酶1 U（不计体积），超纯水12 μL，模板液2 μL。PCR扩增热循环参数为：95 ℃预变性3 min，然后95 ℃ 30 s →55 ℃ ～ 62 ℃（根据引物的退火温度）30 s → 72 ℃ 60 s，循环33个周期，最后72 ℃延长5 min。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统为英国Syngene公司的 G-BOX。

2　结果

2.1一般情况

53株CRAB中，急诊ICU 11株，综合ICU 26株，内科ICU 9株，神经ICU 6株，儿科ICU 1株；男性35株（66.04%），女性18株（33.96%）。详见表2。

表1　耐药基因PCR引物序列[3]Tab 1　PCR primer sequence of drug-resistant genes[3]

表2　CRAB的分类检出情况Tab 2　The classification about the detection of CRAB

2.2耐药情况分布

本研究检测了53株医院感染CRAB对15种抗菌药物的耐药情况，详见表3。

表3　53株医院感染CRAB的药敏特点分布情况Tab 3　Distribution of the drug-sensitive characteristics of 53 strains of nosocomial acquired CRAB

2.3耐药基因检测情况分布

对妥布霉素敏感的16株CRAB，氨基糖苷类修饰酶基因检出：armA（81.25%，13/16），aph(3')-I（75.00%，12/16），aac(3)-I（6.25%，1/16），aac(6')-Ib（0/16）。对复方新诺明敏感的33株CRAB，磺胺耐药基因检出：sul1（9.09%，3/33），sul2（48.48%，16/33）。详见表4。

表4　53株医院感染CRAB的耐药基因检测分布情况Tab 4　Distribution of the detection results of drug-resistant genes of 53 strains nosocomial acquired CRAB

2.4耐药基因检出与耐药情况对比研究

共14组（每组2株细菌）耐药基因检出与耐药情况完全相同的菌株，其中综合ICU 9组、神经ICU 2组、急诊ICU 2组和内科ICU 1组。14组CRAB中，住院日期无交叉的有内科ICU组（16号2014-03-28入院，2014-05-14出院；37号2014-06-01入院，2014-07-07出院）；综合ICU组（17号2014-04-23入院，2014-07-31出院；81号2015-01-02入院，2015-01-31出院；88号2015-01-16入院，2015-04-13出院；92号2014-10-22入院，2014-11-03出院）。不同ICU耐药基因检出与耐药情况完全相同的菌株排列详见表5。

3　讨论

综上，本研究结果提示，男性感染CRAB多于女性。鲍曼不动杆菌院内感染最常见的部位是肺部，是医院获得性肺炎尤其是呼吸机相关性肺炎重要的致病菌[4]，CRAB多分离自痰标本，考虑与重症监护病房患者多使用呼吸机相关。60岁以上老年人送检痰标本分离率最高，分析原因是由于老年患者呼吸器官退化，呼吸功能及咳嗽反射减弱，肺组织弹性减弱等导致排痰功能降低，更易在医院内感染CRAB引起肺炎。

本研究结果表明，CRAB除对复方新诺明、妥布霉素较敏感外，对其余13种抗菌药物耐药率均达50%以上（见表3），耐药形势严峻。本院获得的CRAB仍可考虑选用复方新诺明和妥布霉素进行治疗,与湖北黄石、苏州、广东省中山市的报道结果并不一致[5-7]。产生抗菌药物灭活酶是鲍曼不动杆菌耐药的重要机制[2]，产酶与携带耐药基因相关。53株CRAB对β-内酰胺类抗菌药物均耐药，同时所有菌株均携带TEM基因，故我院定居并繁殖的CRAB耐β-内酰胺类抗菌药物的机制可能与TEM酶密切相关。有研究[8]曾证明OXA-23型碳青霉烯酶在鲍曼不动杆菌对碳青霉烯类耐药中起着重要作用。携带OXA-23基因可能是本院鲍曼不动杆菌耐碳青霉烯类抗菌药物的重要因素。SHV检出低，VEB、CARB、DHA、IMP、VIM、PER均未检出，检出率低的耐药基因可能在本院分离CRAB耐β-内酰胺类抗菌药物机制中的作用不大。研究氨基糖苷类修饰酶基因和磺胺耐药基因发现，对妥布霉素敏感的CRAB高检出armA、aph(3')-I，低检出aac(3)-I、aac(6')-Ib，对复方新诺明敏感的CRAB高检出sul2，低检出sul1，其关联性有待进一步探讨。

表5　各ICU耐药基因和药敏特点相同的菌株分布情况Tab 5　Distribution of the same drug resistance gene and drug sensitive characteristics of strains in each ICU department

考虑耐药情况和耐药基因检出完全一致的菌株可能具有同源性，提示我院不仅存在科室内部的交叉感染，且存在科室间的交叉感染，尤其是内科ICU和综合ICU存在长期定植菌，说明临床的清洁消毒工作不彻底，科室之间传播的流行病学特点值得深入研究。

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The study and analysis of drug resistance genes of nosocomial infection CRAB in ICU

CHEN Lu,LI Ling-zhu,LENG Ying-rong,ZHA Zhu-hong,CHENG Yong-su,HUANG Bing,LUO Guang-ying,WANG Min,JIANG Yin-hui(The Infection Control Section of Guizhou Medical University,Guiyang 550004,China)

Objective: To analyze the situation of antimicrobial resistance,related resistance genes and possible mechanism,and provide references for rational antimicrobial application and discover the epidemiological characteristics of CRAB in our hospital. Methods: PCR techniques were used to test OXA-23,TEM,SHV,VEB,CARB,DHA,VIM,IMP,PER,aac(3)-I,aac(6')-Ib,aph(3')-I,armA,sul1 and sul2 genes. Results: In addition to SMZ-TMP and tobramycin,resistant rate to 13 antibiotics were all over 50%. The detection rate of gene were TEM 100%,OXA-23 96.23%,armA 90.57%,aac(6')-Ib 22.64%,aac(3)-I 26.42%,aph(3')-I 73.58%,sul1 30.19%,sul2 56.60% and SHV 3.77%. VEB,CARB,DHA,IMP,VIM and PER were not detected. There were 14 bacterial groups which had the same drug resistance and drug resistance gene. Conclusion: SMZ-TMP and tobramycin can be used to cure the CRAB infected patients. The TEM gene may be closely related to β-lactams resistance. The OXA-23 may be a crucial factor for carbapenems resistance. Those genes with low detection rate may not play a big role in drug resistant mechanism. There are cross infection in the same department and among departments in our hospital,infection control should be strengthened.

Carbapenem-resistant Acinetobacter baumannii; Drug resistance; Drug resistance gene; Nosocomial infection

R978.1

A

1672 - 8157(2016)01 - 0052 - 04

贵州省科技计划项目（黔科合SY字2013-3176号）

冷应蓉，女，主任技师，主要从事医院感染管理。E-mail：49728467@qq.com

陈璐，女，主治医师，主要从事病原菌耐药机制研究。E-mail：49728467@qq.com

（2015-10-11

2015-12-16）