重组人对氧磷酶1K192亚型对毒死蜱所致SD大鼠急性肝损伤的保护作用

2016-11-22 02:59张帆韩新飞张娜张鹏思赵敏
中国医科大学学报 2016年2期
关键词:光镜染毒毒死

张帆,韩新飞,张娜,张鹏思,赵敏

(中国医科大学附属盛京医院1.急诊科;2.社会服务部,沈阳 110004)

·论著·

重组人对氧磷酶1K192亚型对毒死蜱所致SD大鼠急性肝损伤的保护作用

张帆1,韩新飞1,张娜1,张鹏思2,赵敏1

(中国医科大学附属盛京医院1.急诊科;2.社会服务部,沈阳 110004)

目的 探讨重组人对氧磷酶1K192亚型(rHuPON1K192)对毒死蜱中毒导致的大鼠急性肝脏损伤的保护作用。方法将健康成年SD大鼠50只随机分为正常组(A组)、rHuPON1K192对照组(B组)、毒死蜱染毒组(C组)、低剂量rHuPON1K192预处理组(D组)、高剂量rHuPON1K192预处理组(E组),每组10只。C、D、E组均给予毒死蜱灌胃,D组在灌毒30 min前予以rHuPON1K192 4 500 U/kg尾静脉注射,E组予以9 000 U/kg rHuPON1K192尾静脉注射,A组予以与毒死蜱同体积生理盐水灌胃,B组则单纯予以rHuPON1K192尾静脉注射。8 h后取血,采用速率法检测谷丙转氨酶(ALT)及谷草转氨酶(AST)的活性,采用ELISA法检测苹果酸脱氢酶(MDH)及谷氨酸脱氢酶(GLDH)的活性;取肝脏组织行免疫组化检测缺氧诱导因子1α(HIF-1α)的表达,采用光镜、透射电镜检查超微结构的改变。比较各组之间相关指标的差异。结果 比较A组与B组各项指标,差异均无统计学意义(P>0.05)。C组肝功能指标ALT、AST、GLDH及MDH较A组均有明显升高(P<0.01),HIF-1α呈重度表达,电镜与光镜下肝细胞膜、线粒体等出现明显损伤。D组及E组上述指标较A组轻度升高,E组改变程度较D组稍轻,2组各指标相比无统计学差异(P>0.05)。D组及E组上述指标改变较C组轻,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 rHuPON1K192对毒死蜱中毒肝损伤具有保护作用。

SD大鼠;毒死蜱;重组人对氧磷酶1K192;肝损伤

毒死蜱作为有机磷农药的一种,所致中毒在临床上较常见,然而传统的救治手段治疗效果不尽理想,急需找到一种更好的治疗方法。近年来,对氧磷酶1(paraoxonase 1,PON1)水解有机磷的作用使其成为此领域研究的热点。本研究拟探讨重组人对氧磷酶1K192亚型(recombinant human K192 subtype of paraoxonase 1,rHuPON1K192)对毒死蜱中毒所致急性肝损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物:取健康成年雄性SD大鼠50只,SPF级,体质量(300±50)g,购自北京华阜康生物科技股份有限公司[许可证号SCXK(京)2014-0004],由中国医科大学附属盛京医院动物实验中心饲养。

1.1.2 主要试剂与仪器:45%毒死蜱乳油(天津汉邦植物保护剂有限责任公司);rHuPON1K192[自行制备:截取人类PON1基因序列为目标片段,修改其192位密码子为AAA(编码赖氨酸),经DNA内切酶及连接酶与质粒连接后获得含有rHuPON1K192的阳性表达载体。将重组质粒转化至菌株细胞内培养诱导,超声破碎菌体细胞,离心后层析取上清纯化,经E.Coli表达、聚乙二醇修饰提纯后,获得85% rHuPON1K192蛋白样本,检测其活性为350.03 U/L,具有更高溶解性、稳定性及长半衰期,于-80℃冰箱保存待用];多聚甲醛及戊二醛(国药集团化学试剂有限公司);谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(glutamic-oxalacetic transaminase,AST)检测试剂盒(美国雅培公司);鼠谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase,GLDH)、苹果酸脱氢酶(malic dehydrogenase,MDH)ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所有限公司);兔抗鼠多克隆缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)抗体(美国Proteintech公司),羊抗兔二抗试剂盒(北京中杉金桥生物技术公司);ELx808全自动生化分析仪(美国BioTek公司);CX-41普通光学显微镜(日本OLYMPUS公司);H-7650型透射电子显微镜(日本HITACHI公司),E800型生物光学显微镜照相机(日本Nikon公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型制备:将50只大鼠随机分为正常组(A组)、rHuPON1K192对照组(B组)、毒死蜱染毒组(C组)、低剂量rHuPON1K192预处理组(D组)、高剂量rHuPON1K192预处理组(E组),每组10只。C、D、E组均给予毒死蜱灌胃,D组在灌毒30 min前予以rHuPON1K192 4 500 U/kg尾静脉注射,E组予以9 000 U/kg rHuPON1K192尾静脉注射,A组给予与毒死蜱同体积生理盐水灌胃,B组则单纯予以rHu-PON1K192尾静脉注射。

1.2.2 取材:各组大鼠染毒8 h,麻醉后开腹,分离出新鲜肝组织,多聚甲醛中固定,以备组织学光镜以及免疫组化检测;另取各组肝组织于戊二醛中固定,备透射电镜检查。腹主动脉采血离心后,取上清存于-80℃冰箱,以检测相关酶学指标。

1.2.3 速率法检测ALT、AST活性:连续检测反应过程中底物浓度的变化,求酶反应的初始速度,再检测吸光度曲线中线性期的吸光度值,计算酶活性。

1.2.4 ELISA法检测GLDH、MDH活性:在96孔板上设好各孔位置后加样,孵育、弃液、甩干、洗涤后,依次滴加待测溶液,再滴加底物溶液避光显色,终止显色后,在酶标仪450 nm波长下测量光密度。

1.2.5 免疫组化法检测HIF-1α的表达:肝脏组织经固定、脱水、透明、包埋、切片及微波热修复后,依次加入3%过氧化氢、山羊血清封闭游离结合位点,滴加一抗过夜,次日加入二抗、辣根过氧化物酶标记的链酶卵白素工作液,DAB显色后,经脱水透明封片,进行图像分析。

1.2.6 光镜观察:取肝组织经固定、脱水、透明及包埋后切片,HE染色,树脂封片,光镜下观察。

1.2.7 透射电镜观察:肝组织浸泡于3%的戊二醛中固定,用锇酸后固定,梯度乙醇脱水,环氧丙烷浸泡,包埋剂浸透过夜后,聚合切片,经醋酸铀及柠檬酸铅染色,透射电镜下观察。

1.3 统计学分析

采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理。计量资料采用表示,组间比较采用ANOVA检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况

各组大鼠处理8 h后麻醉前一般情况见表1。C组大鼠出现流泪流涎,大小便失禁,肌颤,萎靡,反应迟钝等典型的毒死蜱中毒症状。

2.2 ALT、AST、MDH、GLDH活性

如表2所示:A组与B组大鼠ALT、AST均在正常范围内,无统计学差异;C组ALT、AST显著高于A组,差异有统计学意义(P<0.01);D组及E组ALT、AST指标稍高于A组,均无统计学差异;C组与2个rHuPON1K192预处理组间差异有统计学意义(P<0.05);D组和E组ALT、AST无统计学差异(P>0.05)。

表1 各组大鼠一般情况Tab.1 General information of rats in each group

表2 大鼠肝损伤血清学指标及阳性面积指数变化()Tab.2 Changes of serum markers and positive area index of liver injury in rats()

表2 大鼠肝损伤血清学指标及阳性面积指数变化()Tab.2 Changes of serum markers and positive area index of liver injury in rats()

1)P<0.01 vs group A;2)P<0.05 vs group C.

Group n ALT(U/L) AST(U/L) GLDH(U/L) MDH(U/L) Positive area index A 10 59.115±15.718 121.185±22.854 3.025±0.541 4.787±1.839 1 223.883±324.052 B 10 57.296±13.457 126.192±32.048 3.164±0.521 4.916±1.474 1 215.635±273.305 C 10 169.157±32.6511) 225.107±46.1041) 9.172±1.3301) 11.536±1.6201) 3 313.336±477.7871)D 10 77.139±17.8882) 150.969±30.9262) 3.753±0.7502) 6.319±0.7962) 1 606.878±364.4312)E 10 71.487±16.3522) 132.368±18.4622) 3.279±0.7882) 5.443±1.3152) 1 386.480±366.1392)

2.3 GLDH及MDH的异常升高与ALT变化程度的相关性

以GLDH为y轴,ALT为x轴,得出线性方程为y=0.052 3x-0.064 8(R2=0.937 9,F=716.719 0,P<0.01),说明两者有很好的直线关系。同样以MDH为y轴,ALT为x轴,求得线性方程为y=0.059 6x+ 1.424 0(R2=0.911 6,F=493.623 5,P<0.01),证明两者有良好的直线关系。提示大鼠MDH、GLDH的异常升高与ALT的改变有高度相关性。见图1。

图1 GLDH、MDH与ALT变化趋势Fig.1 Variation trend among GLDH,MDH and ALT

2.4 各组大鼠肝组织中HIF-1α抗体的表达

A、B组大鼠HIF-1α抗体的表达呈弱阳性,视野中鲜有淡黄色(图2A、2B);C组呈重度表达,呈满视野深棕黄色(图2C);D组轻度表达,呈淡黄色(图2D);E组呈极轻度表达,散在少量淡黄色(图2E)。应用NIS-Elements F3.0图像采集软件照相并检测阳性面积指数结果见表2。

2.5 各组大鼠肝组织光镜及电镜下病理表现

图2 各组肝细胞HIF-1α抗体免疫组化染色 ×400Fig.2 Immunohistochemical staining analysis of HIF-1α of liver cells×400

A、B组肝细胞膜完整,线粒体丰富,内质网完整(图3A、3B、4A、4B);C组肝细胞浑浊肿胀明显,体积增大、气球样变,有较多炎性细胞浸润,核固缩、碎裂,呈崩裂倾向,线粒体疏松溶解肿胀(图3C、4C);D组肝细胞稍肿胀,体积稍大,炎性细胞稍有浸润,线粒体少有溶解,数量减少(图3D、4D);E组肝细胞轻微肿胀,可见轻度水样变,较少炎性细胞浸润,线粒体排列稍欠规则,基质疏松欠致密(图3E、4E)。

3 讨论

毒死蜱是常用的有机磷农药,通过使胆碱酯酶(cholinesterase,ChE)磷酰化抑制其活性,从而使体内乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)无法分解而蓄积,产生毒蕈碱样、烟碱样及神经系统症状。本研究中,染毒组大鼠出现流泪流涎,大小便失禁,肌颤,萎靡,反应迟钝等典型的毒死蜱中毒症状。

图3 各组肝细胞HE染色 ×400Fig.3 HE staining of liver cells×400

图4 各组肝细胞电镜表现 ×8 000Fig.4 TEM observation of liver cells×8 000

有机磷中毒患者常有肝损伤。ALT、AST是国际公认监测肝损伤的指标,但因ALT的敏感度欠佳,且心肌损伤时AST也发生改变,临床上急需更好的验证指标。GLDH主要存在于肝细胞线粒体中,当线粒体膜破坏时,GLDH能先于ALT释放入血,故Harrill等[1]提出将GLDH作为肝损伤标志物。近年发现血清MDH与肝损伤有一定联系,它是一种门静脉周围酶,在三羧酸循环中参与草酰乙酸与苹果酸的转化,该循环遭到破坏时肝细胞中的MDH迅速释放入血清,而此时ALT并未改变[2]。本研究发现染毒组细胞膜及线粒体出现严重病理损伤,血清ALT、AST、GLDH、MDH均有不同程度增高,且ALT与GLDH、MDH的改变呈正相关,有力地证明了GLDH、MDH的改变与肝损伤密切相关。因GLDH、MDH更为准确和特异,故日渐成为优于ALT、AST的新兴肝功能损伤指标。

本研究结果显示,HIF-1α在染毒组肝细胞中表达水平较高,提示其与毒死蜱肝细胞损伤有关。HIF-1α是低氧应激时转导基因编码合成的蛋白质[3],可维持氧代谢稳态,与肝细胞线粒体凋亡、炎性介质释放有关。在氧化应激调动时,HIF-1α作为机体抗氧化程序的总开关,蓄积下游辅助因子如血管内皮生长因子、肿瘤坏死因子α、白细胞介素1β等[4],启动脯氨酸羟基化过程,从而引起过多的HIF-1α与羟基化后的脯氨酸结合,随后大量氧自由基破坏肝细胞膜的完整性、干扰膜的CA2+-ATP酶系,使细胞内外钙离子的稳态破坏而损伤肝细胞及线粒体的结构。有机磷致肝损伤涉及氧化应激过程,HIF-1α作为肝细胞氧化应激的始动因素功能不可小觑,其下游相关因子可起到破坏肝细胞超微结构的作用,影响代谢,促进炎性介质释放,加重损伤,本研究结果也充分证明了这一论点。

rHuPON1K192是PON1的一种人工合成亚型,具有更高的溶解性、稳定性及长半衰期。PON1是由肝脏合成分泌的酯酶,可保护脂蛋白不被氧化,且能够催化水解磷酸酯键。192位点的氨基酸基团是影响此酶活性的关键位点[6],该位点为赖氨酸时,PON1表达型活性最高。当毒死蜱侵入肝细胞后可造成氧化-抗氧化系统失衡,而rHuPON1K192可催化磷酸酯键、调节氧化应激平衡、清除氧自由基、增强抗氧化,抑制HIF-1α表达,增加肝细胞膜及细胞器稳定性,减少肝酶释放[7]。研究证实,外源增加PON1可减少有机磷中毒程度,且PON1针对于毒死蜱的水解率明显大于其他有机磷化合物,可有效降低毒死蜱入血量和峰浓度,减轻AchE的抑制[8],缓解症状,肝保护作用优于现有的其他解毒剂[9]。本研究中,单纯rHuPON1K192处理组大鼠与正常组无显著差别,说明rHuPON1K192对肝脏无明显毒性。经rHuPON1K192预处理后的大鼠各项指标及病理变化均轻于染毒组,说明外源增加rHuPON1K192可减轻毒死蜱的中毒程度;高剂量rHuPON1K192预处理组大鼠与低剂量组相比,上述指标改变更为轻微,证明足量的rHuPON1K192对肝功能保护作用更佳,确切证明了它的优越性和安全无害性。

综上所述,外源的rHuPON1K192对机体肝功能安全无损害,且具有催化磷酸酯键、调节氧化应激平衡的解毒作用。本研究结果为治疗毒死蜱中毒所致急性肝损伤提供了一条新途径。

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(编辑 王又冬)

Protective Effectofthe Recombinant Human K192 Subtype ofParaoxonase1 on Chlorpyrifos-induced Acute Liver Injury in SD Rats

ZHANG Fan1,HANXin-fei1,ZHANGNa1,ZHANGPeng-si2,ZHAOMin1
(1.Emergency Department,Shengjing Hospital,China MedicalUniversity,Shenyang 110004,China;2.SocialService Department,Shengjing Hospital,China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To investigate the protective effect of recombinant human K192 subtype of paraoxonase 1(rHuPON1K192)on acute chlorpyrifos poisoning induced liver injury in rats.Methods Totally 50 healthy adult SD rats were randomly assigned into five equal groups,including normal group(group A),rHuPON1K192 control group(group B),chlorpyrifos group(group C),low dose rHuPON1K192 pretreated group(group D),and high dose rHuPON1K192 pretreated group(group E).Group C,D and E were given intragastric administration ofchlorpyrifos.Group D was given rHuPON1K192 by caudal intravenous injection according to 4 500 U/kg 30 min before intragastric administration of chlorpyrifos.Group E was given rHuPON1K192 according to 9 000 U/kg.Group A received same volume of saline by intragastric administration.Group B was only given rHu-PON1K192 by caudalintravenous injection.After8 hours,the ratswere anesthetized and the blood was harvested.The activity ofalanine aminotransferase(ALT)and glutamic-oxalacetic transaminase(AST)was detected by rate method,and the activity of malic dehydrogenase(MDH)and glutamate dehydrogenase(GLDH)wasdetermined by ELISA method.The expression ofhypoxia inducible factor-1α(HIF-1α)in livertissue was detected by immunohistochemical method.The liver tissue was examined by light microscope and transmission electron microscope(TEM).Finally the differences among the groups were compared.Results There was no significant difference between group A and group B(P>0.05).Compared with group A,the liverfunction indexes ofALT,AST,GLDH and MDHexhibited significantincrease in group C,a higherexpression ofHIF-1αwas also observed,and the pathological observation showed severe damage of cell membrane and mitochondrion(P<0.01).The above indexes in groupD and group E were slightly elevated compared with group A,the change in group E was smaller than that of group D.There was no significantdifference between the two groups(P>0.05).The above indexes change in group D and group E were lighter than those in group C(P<0.05).Conclu⁃sion rHuPON1K192 hasa protective effecton liverinjury induced by chlorpyrifospoisoning.

SD rat;chlorpyrifos;rHuPON1K192;liver injury

R575.5

A

0258-4646(2016)02-0101-06

10.12007/j.issn.0258-4646.2016.02.002

国家自然科学基金(81171793);盛京自由研究者计划

张帆(1989-),女,医师,硕士研究生.

赵敏,E-mail:zhaom@sj-hospital.org

2015-10-20

网络出版时间:

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