奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐成分分析基体标准物质的应用

王智聪，冯炫，余笑波，沙跃兵

（浙江省计量科学研究院，浙江杭州310018）

奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐成分分析基体标准物质的应用

王智聪，冯炫，余笑波，沙跃兵

（浙江省计量科学研究院，浙江杭州310018）

建立了奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐含量准确测定的方法，以奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐成分分析基体标准物质作为质控品进行方法学的考察与评价。奶粉样品经低温-酸沉淀/固相萃取净化，采用离子色谱-电导检测分析。结果表明，亚硝酸盐（以NO2-计）和硝酸盐（以NO3-计）分别在0.010 μg/mL～0.500 μg/mL和0.100 μg/mL～5.00 μg/mL的范围内线性良好，相关系数（r）均大于0.99，在奶粉中的最低定量限分别为0.400/4.00mg/kg（NO2-/NO3-）；亚硝酸盐和硝酸盐测定方法中的基质效应分别为95.6%/99.6%（NO2-/NO3-）；基于基质效应的加标回收率分别为90.3%/87.1%（NO2-/NO3-）；以奶粉基体标准物质进行方法学考察，方法的准确性分别为90.5%/89.9%（NO2-/NO3-），精密度（RSD）分别为2.1%/0.7%（NO2-/ NO3-）。奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐成分分析基体标准物质作为质控品，可以用于分析测试方法的评价、实验室结果的比对，以及相关行业奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐含量监测量值传递体系的建立，为奶粉的质量控制和安全评价提供保障。

奶粉；亚硝酸盐；硝酸盐；奶粉基体标准物质

亚硝酸盐可以在生物体内与胺类物质生成致癌性极强的亚硝基化合物，硝酸盐在体内能够还原为亚硝酸盐，并且还可以内源性形成亚硝胺类物质，从而威胁人体健康［1-3］。在我国，1999～2008年公开报道的亚硝酸盐食物中毒案例有237起，中毒3500人，其中死亡35人［4］。奶粉中含有多种营养成分，如蛋白质、脂肪、碳水化合物、矿物质和多种营养添加剂等，技术要求必须符合国家标准《食品安全国家标准乳粉》（GB 19644-2010）的规定。在奶粉的生产、加工、储藏、运输及使用过程中，可能会引入或产生微量的亚硝酸盐和硝酸盐。我国国家标准《食品安全国家标准食品中污染物限量》（GB 2762-2012）中规定了相关污染物的限量，其中，乳粉中亚硝酸盐的最大允许浓度为2.00 mg/kg（以NaNO2计），婴幼儿配方食品中硝酸盐的最大允许浓度为100 mg/kg（以NaNO3计）。

乳品中亚硝酸盐和硝酸盐的国家标准检测方法是《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》（GB 5009.33-2010），在第二法“分光光度法”和第三法“乳及乳制品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定”中，亚硝酸盐采用基于重氮-偶合反应机理的分光光度法测定，而硝酸盐均采用镉柱还原为亚硝酸盐后间接测定。其中，镉柱还原法操作复杂繁琐，亚硝酸盐和硝酸盐需分步测定，而且测定干扰因素多，专属性差，重现性不好，不适宜大批量样品的检测；同时，镉对试验操作人员具有潜在的危害，对环境也容易造成污染。第一法“离子色谱法”样品前处理简便、快速，且容易批量制备，文献中多采用离子色谱法进行乳制品中亚硝酸盐和硝酸盐含量的测定［5-11］。但是该方法中亚硝酸盐和硝酸盐标准曲线的基质和测试样品不一致，并且奶粉中亚硝酸盐的含量较低，由于奶粉基质的干扰较大，对样品前处理和色谱分离提出了较大的挑战。另外，由于缺乏亚硝酸盐和硝酸盐的奶粉基体标准物质，不同的分析测试方法和不同实验室之间的结果很难进行比对。最近，李筱翠等［12］报道了脱脂乳粉中亚硝酸盐和硝酸盐标准物质的制备技术，可望用于乳粉中亚硝酸盐和硝酸盐含量的研究。本文改进了国标第一法“离子色谱法”，并考察了基质效应对奶粉样品测定的影响，同时采用具有量值准确的奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐成分分析基体标准物质作为质控品，提高了分析过程的有效性和测试结果的可靠性。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

乙酸（分析纯）：购自Sigma-Aldrich公司；试验用水为Milli-Q制备的超纯水；亚硝酸盐水溶液标准物质（以NO2-计，1 000 μg/mL，Urel=2%，k=2）、硝酸盐水溶液标准物质（以NO3-计，1 000 μg/mL，Urel=1%，k= 2）、奶粉中亚硝酸盐（以NO2-计，17.0 mg/kg）和硝酸盐（以NO3-计，168 mg/kg）成分分析基体标准物质：均由浙江省计量科学研究院提供；C18固相萃取柱：购自美国Waters公司；奶粉样品：购自当地超市。

1.2仪器与设备

ICS-2100型离子色谱系统，配淋洗液在线发生装置、ASRS型抑制器、电导检测器和50 μL定量环：美国戴安公司；SQP型精密电子天平：瑞士梅特勒公司；2-16KL型冷冻离心机：美国Sigma公司；Milli-Q超纯水系统：美国Millipore公司；KQ-100DE型数控超声波清洗器：昆山超声仪器有限公司；电子连续等分移液器：德国Brand公司。

1.3方法

1.3.1标准溶液的配制

准确移取亚硝酸根离子（NO2-）标准溶液2.00 mL和硝酸根离子（NO3-）标准溶液20.0 mL于1 000 mL容量瓶中，用含0.06%（体积分数）的乙酸水溶液稀释至刻度，配成浓度分别为2.00/20.0 μg/mL（NO2-/NO3-）的亚硝酸盐和硝酸盐混合标准使用液；再用含0.06%（体积分数）的乙酸水溶液系列稀释，配成含亚硝酸根/硝酸根离子浓度为分别为0.010/0.100、0.020/0.200、0.040/0.400、0.060/0.600、0.080/0.800、0.100/1.00、0.150/ 1.50、0.200/2.00、0.500/5.00 μg/mL的混合标准工作溶液。

1.3.2供试样品的制备

称取奶粉试样1.25 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，加超纯水40.0 mL，摇匀，超声30 min，加入3%乙酸水溶液1.00 mL，于4℃放置20 min，取出放置至室温，再加10.0 mL超纯水，摇匀，于9 000 r/min离心15 min。取上清液适量过C18柱（使用前依次用10.0 mL甲醇、15.0 mL超纯水通过，静置活化30 min），弃去前面5 mL，收集后面洗脱液待测。

1.3.3色谱条件

阴离子色谱分析柱为IonPac AS19（4×250 mm），保护柱为IonPac AG19（4×50 mm）；柱温为30℃；电导检测池温度为35℃；进样体积为50 μL；淋洗液为氢氧化钾溶液，由淋洗液自动发生器在线产生；流速为1.3 mL/min；梯度程序为5 mmol/L保持33 min，1 min上升至50 mmol，50 mmol/L保持5 min，1 min降至5 mmol，5 mmol/L保持5 min。

2　结果与讨论

2.1样品前处理方法的优化

奶粉基体成分复杂，除含有蛋白质、脂肪、碳水化合物之外，还添加多种食品添加剂，如不同种类的功能成分维生素类、植物油类、核苷酸类、氨基酸类、糖类和无机盐类等。去除蛋白质及脂肪常用的方法有无机盐沉淀法、酸沉淀法、有机溶剂沉淀法、低温沉淀法、透析法和固相萃取法等。无机盐沉淀法如醋酸锌/亚铁氰化钾、钨酸钠/硫酸、乙酸铅/三氯乙酸等方法，会引人大量的金属离子，从而干扰结果的测定；有机溶剂沉淀法不利于无机离子从奶粉样品中析出，高含量的有机溶剂也不利于后续固相萃取进一步净化；而低温-酸沉淀结合固相萃取法操作简单、回收率高，国标GB 5009.33-2010《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》第一法“离子色谱法”即采用这样的样品前处理方法。但国标方法中采用容量瓶进行沉淀，操作繁琐、不易批量进行、效率低；同时，沉淀后采用滤纸过滤的方法除去颗粒沉淀，滤液再进行固相萃取时容易堵塞固相萃取柱。本文改进了国标方法，采用离心管作为沉淀器皿，所需液体体积采用电子连续等分移液器进行准确吸取；同时，沉淀后样品直接离心，取上清液即可进行固相萃取，改进后的方法简便易行、效率高、批次重复性好，适于大批量样品测定。

2.2色谱条件的优化

试验比较了不同浓度氢氧化钾洗脱的情况，如20、15、10 mmol/L和5 mmol/L氢氧化钾等度洗脱以及梯度洗脱的方式。采用高浓度的氢氧化钾，亚硝酸根和硝酸根离子虽然洗脱较快，但与杂质的分离度较差，如采用20 mmol/L氢氧化钾，亚硝酸根离子与氯离子后面的杂质不能基线分离；采用5 mmol/L氢氧化钾等度洗脱，亚硝酸根和硝酸根离子均与杂质实现基线分离，含量较高的氯离子对测定也无影响，如图1所示。由于奶粉基质组成复杂，亚硝酸根和硝酸根离子洗脱之后还需要高浓度的氢氧化钾清洗色谱柱，从图1也可看出，在清洗阶段有大量杂质洗脱出来。

图1　奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐的离子色谱分析谱图Fig.1　Ion chromatogram of nitrite and nitrate in milk powder sample

2.3工作曲线、检出限和最低定量限

按1.3.1节所述试验方法配制亚硝酸根和硝酸根离子的混合标准工作溶液，在优化的色谱条件下进行测定，以峰面积（μS·min）为纵坐标，亚硝酸根或硝酸根离子的浓度（μg/mL）为横坐标进行线性分析，如图2所示。

图2　亚硝酸根和硝酸根离子的线性标准曲线Fig.2　Calibration curves of nitrite and natrate

由图2可知，回归方程分别为Y=0.306 52X+ 0.003 21和Y=2.713 04X+0.016 82，相关系数（r）分别为0.999 62和0.999 87。亚硝酸根和硝酸根离子的线性范围分别是0.010 μg/mL~0.500 μg/mL和0.100 μg/mL~ 5.00 μg/mL。以3倍信噪比计算检出限，亚硝酸根和硝酸根离子的检出限分别为0.005 μg/mL和0.009 μg/mL，对应奶粉的检出限分别为0.200 mg/kg和0.36 mg/kg。

国标GB 5009.33-2010《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》第一法“离子色谱法”给出奶粉中亚硝酸盐（以NO2-计）和硝酸盐（以NO3-计）的检出限分别为0.200 mg/kg和0.400 mg/kg，国标方法中对亚硝酸根和硝酸根离子的曲线拟合，采用通过原点的线性拟合方式，标准曲线中除零点之外的最低点分别为0.020 μg/mL和0.200 μg/mL。由于国标中没有给出最低定量限（LOQ），如以零计算，显然不合理，因为最低定量限不可能低于检出限；如以标准曲线中非零的最低点为最低定量限，对亚硝酸根和硝酸根离子，在奶粉中则分别为0.800 mg/kg和8.00 mg/kg。但在奶粉样品的实际测定过程中，通常遇到奶粉中亚硝酸根离子的含量小于0.800 mg/kg以及硝酸根离子的含量小于8.00 mg/kg的情况，这样就很难给出实际测定值，否则，则是最低定量限外推计算得到的浓度。本文在国标方法的基础上作了改进，在标准曲线下线增加一个浓度点0.010/0.100 μg/mL（NO2-/NO3-），这样，以此点为最低定量限，对应奶粉中亚硝酸根和硝酸根离子的最低定量限分别为0.400 mg/kg和4.00 mg/kg。

2.4基质效应

在国标GB 5009.33-2010《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》第一法“离子色谱法”中，亚硝酸盐和硝酸盐标准工作溶液用水进行系列稀释后直接测定，并通过该标准曲线计算未知样品的含量；在奶粉样品的前处理方法中，采用乙酸低温沉淀蛋白的方法去除蛋白质等。由于在奶粉样品的前处理过程中添加了乙酸，以及由于奶粉基质的影响，待测奶粉样品与标准曲线工作溶液的基质不一致，在电导检测中造成信号响应的差异，即产生基质效应。为评价基质效应的影响，分别用超纯水和含0.06%（体积分数）的乙酸水溶液稀释亚硝酸盐和硝酸盐标准溶液，配制低浓度（0.050/0.500 μg/mL，NO2-/NO3-）和高浓度（0.400/4.00 μg/mL，NO2-/NO3-）的混合溶液，进行离子色谱分析并比较峰面积。对亚硝酸根离子，在低浓度和高浓度水平，基质效应分别为94.5%和96.6%，平均值为95.6%；对硝酸根离子，在低浓度和高浓度水平，基质效应分别为99.3%和99.8%，平均值为99.6%。可见，对亚硝酸根离子，基质效应影响比较大。究其原因，虽然亚硝酸根和杂质实现基线分离，但是乙酸峰拖尾对亚硝酸根的电导检测造成影响；相比而言，硝酸根的保留时间较大，乙酸峰对其影响也较小，其基质效应较小。文献中对奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐含量的测定均采用水配制标准工作溶液［6-11］，基于离子色谱-电导检测法中测定亚硝酸盐的基质效应，在奶粉样品测定中造成亚硝酸盐的含量偏低。因此，为了矫正基质效应的影响，配制标准工作溶液应该采用含0.06%（体积分数）的乙酸水溶液进行稀释。

2.5基于基质效应的加标回收率

称取奶粉样品1.25 g，加入适量的亚硝酸根和硝酸根离子标准溶液，再加入适量超纯水使得总体积为40 mL，其余步骤按1.3.2节进行样品的前处理，每个试样平行制备3份，按试验方法进行测定，结果见表1。

表1　奶粉中亚硝酸根和硝酸根离子的加标回收试验结果（n=3）Table 1　Recoveries of nitrite and nitrate in milk powder（n=3）

由表1可以看出，添加2种不同浓度水平的亚硝酸根和硝酸根离子，平均加标回收率分别为90.3%和87.1%。

2.6方法准确性和精密度

称取奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐成分分析基体标准物质1.25 g，按照1.3.2节所述方法进行预处理，平行制备6份，按照1.3.3节色谱方法进行测定分析，结果如表2所示，其中准确性为6次测定的平均值与标准值比值的百分含量，精密度为6次测定的相对标准偏差（RSD）。

表2　奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐成分分析基体标准物质测试方法的准确性和精密度Table 2　Accuracy and precision of matrix reference material of nitrite and nitrate in milk powder

在奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐含量测定的文献报道中［6-11］，有些没有进行方法准确性的测定，有些是利用加标回收的方法进行评估，但是，加标回收后测定的浓度并不能真实地反映奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐的含量，一方面是涉及到奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐的绝对提取效率和加标部分的回收率；另一方面是在测定方法中，由于标准曲线和奶粉基质的差异，产生基质效应。因此，需要亚硝酸盐和硝酸盐含量准确的奶粉基质样品进行方法准确性的评价。本试验中采用的奶粉基体标准物质中亚硝酸盐和硝酸盐的含量是经过准确定值的，具有量值准确和可溯源的特点。从表2可以看出，本文建立的方法精密度较好，准确性测定结果偏低，主要是由于奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐的回收率偏低，但与回收率测定结果一致。另外，统计分析相关奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐含量测定的文献，其中亚硝酸盐和硝酸盐含量测定结果差异较大，由于样品前处理和分析测试方法不同，方法准确性难以评估，对不同实验室测定的结果也很难进行比对分析。但是，如果利用奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐成分分析基体标准物质作为质控品进行方法准确性的评估，即使不同实验室采用不同的分析测试方法，或不同实验室采用相同的测试方法都可以进行测试结果的比对。同时，利用奶粉基体标准物质，可以确保奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐含量的测量结果具有溯源性、可比性和准确性。

2.7奶粉样品的测定

对当地超市所购的6种不同品牌的奶粉样品进行亚硝酸盐和硝酸盐含量的筛查，结果见表3。

由表3可以看出，6种奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐的含量均小于国标GB 2762-2012《食品安全国家标准食品中污染物限量》中规定的限值（2.00 mg/kg，以NaNO2计，或1.30 mg/kg，以NO2-计；100 mg/kg，以NaNO3计，或73.0 mg/kg，以NO3-计），其中一种品牌的奶粉未检出亚硝酸盐和硝酸盐。对亚硝酸根离子，其中一种品牌奶粉的含量小于最低定量限（0.400 mg/kg），一种品牌奶粉的含量大于0.800 mg/kg，3种品牌奶粉的含量介于0.400 mg/kg～0.800 mg/kg之间；对硝酸根离子，其中一种品牌奶粉的含量小于最低定量限（4.00 mg/kg），一种品牌奶粉的含量大于8.00 mg/kg，3种品牌奶粉的含量介于4.00 mg/kg～8.00 mg/kg之间。同时也说明，如果采用国标GB 5009.33-2010《食品安全国家标准食品中亚硝酸盐与硝酸盐的测定》方法（亚硝酸根和硝酸根离子的最低定量限分别为0.800 mg/kg和8.00 mg/kg），则本试验筛查的6种奶粉只有一种能够汇报测定值，其他均小于最低定量限（＜LOQ）。鉴于亚硝酸盐的强致毒性，其限量要求非常低，建立灵敏度高和准确性好的检测方法，对其产品质量控制至关重要。

表3　奶粉样品中亚硝酸盐（以NO2-计）和硝酸盐（以NO3-计）的含量（n=3，mg/kg）Table 3　Amounts of nitrite（count as NO2-）and nitrate（count as NO3-）in milk powder samples（n=3，mg/kg）

3　结论

本文建立了奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐含量测定的方法，在样品前处理及定量分析中改进了国标方法，并且利用奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐成分分析基体标准物质作为质控品，用于样品前处理过程及分析测试方法的可靠性和准确性评估。同时，本文所建立的方法及与基体标准物质的配合使用，可以确保测试结果的溯源性、可比性和准确性，有助于生产企业、检测及执法部门对奶粉中亚硝酸盐和硝酸盐的含量进行监测，并在相关行业建立相应的量值传递体系，统一计量标准，对保障食品安全具有重大意义。

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The Application of Matrix Reference Material of Nitrite and Nitrate in Milk Powder

WANG Zhi-cong，FENG Xuan，YU Xiao-bo，SHA Yue-bing
（Zhejiang Province Institute of Metrology，Hangzhou 310018，Zhejiang，China）

An accurate method was developed for the analysis of nitrite and nitrate in milk powder，which using matrix reference material as quality control tool to evaluate the analytical method.Milk powder sample was sequence cleaned by low temperature-acid precipitation and sold phase extraction，and then analyzed by ion chromatography-conductivity detector.The results showed that nitrite and nitrate displayed good linear relationships over the range of 0.010 μg/mL-0.500 μg/mL（NO2-）and 0.100 μg/mL-5.00 μg/mL（NO3-），with correlation coefficients greater than 0.99.The quantitation limits of nitrite and nitrate in milk powder were 0.400 mg/kg and 4.00 mg/kg.The matrix effects of the method for nitrite and nitrate were 95.6%and 99.6%，and the addition recoveries based on matrix effect were 90.3%and 87.1%separately.The accuracies and precisions of the method were 90.5%/89.9%（NO2-/NO3-）and 2.1%/0.7%（NO2-/NO3-）when validated by milk powder matrix reference material.Also，the matrix reference material of nitrite and nitrate in milk powder can be used as quality control tool to evaluate the analytical method，to compare results among labs，to establish the value transferable system for nitrite and nitrate determination and monitor in milk powder industries，and to provide guarantee for quality control and safety evaluation of milk powder.

milk powder；nitrite；nitrate；milk powder matrix reference material

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.21.029

浙江省质监科研计划项目经费资助（20140210）

王智聪（1977—），男（汉），博士，研究方向：化学分析与标准物质的研制。

2015-12-18