碎尸案中腐败肌肉、牙齿的STR分型

汪三存，丁美满，魏晓林，姚斐，张涛

（1.嘉兴市公安局刑侦支队DNA实验室，浙江嘉兴　314001；2.嘉兴市公安局南湖区分局刑侦大队，浙江嘉兴　314001）

碎尸案中腐败肌肉、牙齿的STR分型

汪三存1，丁美满1，魏晓林1，姚斐1，张涛2

（1.嘉兴市公安局刑侦支队DNA实验室，浙江嘉兴314001；2.嘉兴市公安局南湖区分局刑侦大队，浙江嘉兴314001）

法医遗传学；短串联重复序列；试剂盒；疑难检材

碎尸和腐败尸体案件的检材以腐败肌肉组织、骨骼和牙齿为主，成功获得这类腐败、降解检材的STR分型对案件的侦办至关重要。本研究通过联合应用QIAcube全自动核酸纯化仪和REPLI-g®Single Cell试剂盒的方法提取、纯化高度腐败降解组织DNA，以提高严重降解等疑难检材的STR分型成功率。

1　材料与方法

1.1材料

13份检材均来自实验室的检案。其中烹煮尸块的高压锅排气阀滤网内、外侧和绞肉机进料管T形口内侧壁疑似组织擦拭棉签各1份，共3份，塑料PV管内封装19个月的肌肉组织9份，尖牙1颗。

1.2检验过程

1.2.1主要试剂及仪器

REPLI-g®Single Cell试剂盒（德国QIAGEN公司）、QIAamp DNA Investigator试剂盒（德国QIAGEN公司）、Investigator Lyse&Spin Baske试剂盒（德国QIAGEN公司）、QIAcube全自动核酸纯化仪（德国QIAGEN公司）、TissueLyserⅡ骨头粉碎仪（德国QIAGEN公司）、GlobalFiler®PCR扩增试剂盒（美国AB公司）、9700型基因扩增仪（美国AB公司）、3500xl型遗传分析仪和GeneMapper®ID-X1.4分析软件（美国AB公司）。

1.2.2 DNA提取和纯化

组织的DNA提取：剪取肌肉组织块中间部分黄豆大小一块，剪取疑似组织擦拭棉签头部斑迹，置于Investigator Lyse&Spin Baske试剂盒套管中。按照QIAamp DNA Investigator试剂盒推荐的方法裂解2h，按照QIAcube的洗脱体系20μL进行DNA提取。

牙齿的DNA提取：用TissueLyserⅡ骨头粉碎仪低频（10/s，5 s）去掉牙齿表面腐败质后，置于2 mL离心管（Investigator Lyse&Spin Baske试剂盒附带）内，加入去离子水1.5 mL浸泡1 h，去水晾干，再用TissueLyserⅡ骨头粉碎仪高频（25/s，3 s）进行粉碎。牙粉置于另一洁净的2mL离心管内，加入500mL的EDTA脱钙8 h，按照QIAamp DNA Investigator试剂盒推荐的方法加入ATL和PK裂解2h，离心，上清液用QIAcube的洗脱体系20 μL进行DNA提取，获得20 μL DNA模板；沉淀部分为余下的牙粉，再加入500mL的EDTA脱钙8h，按前述方法重复进行ATL和PK裂解，QIAcube洗脱、提取，第二次获得20 μL DNA模板。将两次获得的共计40μL DNA模板，用micro-100柱浓缩至10μL DNA模板备用。

DNA模板的纯化参照REPLI-g®Single Cell试剂盒推荐的方法进行。

1.2.3 STR多态性检验

取6μL上述未经纯化的模板DNA按照Global-Filer®PCR扩增试剂盒推荐的方法，经9700基因扩增仪进行PCR复合扩增，扩增产物应用3500xl型遗传分析仪进行检测，结果GeneMapper®ID-X1.4软件进行数据分析。按照STR分型判读要求［1］进行判读。

未获得良好分型结果的检材模板DNA经纯化后取1μL按上述方法再进行PCR复合扩增及数据分析。

2　结果

13份未经纯化的模板DNA只有3份检材在全部基因座获得良好分型，其余10份检材未在全部基因座获得良好分型（表1）。将未在全部基因座获得良好分型数据的10份检材的余下模板DNA按REPLI-g®Single Cell试剂盒的方法进行纯化，结果9份检材全部获得良好分型数据，仅1份PV管内肌肉组织仍然未获得STR分型数据。

表1　常规扩增所获分型情况

3　讨论

黄娅琳［2］针对新鲜肌肉组织的研究表明，高温烹饪不影响肌肉组织的DNA可检测性，但没有对腐败组织的DNA检测进行研究。腐败组织DNA提取的关键在于充分裂解组织，尽可能去除肌腱筋膜等有形物质和脂肪组织裂解后在液面形成的油脂层影响，确保获得高纯度的模板DNA。

本研究中高压锅排气阀滤网内外侧提取的疑似组织，杂质较多，塑料PV管内的肌肉组织经历了1年半左右的时间，上述检材DNA均高度腐败，严重降解。本研究在DNA提取时，将检材置于Investigator Lyse&Spin Baske试剂盒套管中，加入高效价的PK进行裂解，经过两次套管离心，肌腱、筋膜等不完全消化的有形物质被彻底过滤，也消除了脂肪等形成的油脂液层对后续反应的影响。

QIAcube进行DNA提取的原理属于硅胶膜吸附法，其回收的DNA在纯度和片段大小上都有优势［3］，而且自动化程度高，减少了损失和污染的风险。本研究采用QIAcube进行DNA提取，尽可能提高了DNA的回收率，但由于DNA降解的影响，因此大部分检材的大片段基因座分型效果差，小片段基因座相对较好。

REPLI-g®Single Cell试剂盒说明书介绍，该试剂盒中Phi29聚合酶在DNA复制过程中，其核酸外切酶的活性比Taq酶效价高出1000倍，经该试剂盒纯化或全基因组扩增后，产物DNA片段长度范围在2～100kb，一般超过10kb，产物适合后续测序、STR检测等各种领域。将未获得良好分型的10份检材模板用REPLI-g®Single Cell试剂盒纯化后扩增，9份检材在全部基因座上均获得良好分型，且未出现明显的优势扩增现象。只有1份从骨头上刮取的组织，检材量较少，以肌腱为主，常规扩增检验和用REPLI-g® Single Cell试剂盒纯化后扩增，均未获得任何STR数据，考虑未回收到DNA。

牙齿中DNA含量相对较少，加之时间、环境等因素的影响，牙齿的DNA提取是DNA检验的难点，检材选择上首选用磨牙，次选尖牙［3-4］。牙齿的DNA提取关键在于彻底清除牙齿表面、牙粉的充分脱钙和选择高回收率的DNA提取方法。本研究中的牙齿是一颗较小的尖牙，按常规扩增检验即获得了较好的STR分型效果，分析原因可能为：（1）用TissueLyserⅡ低频清洁牙齿表面比人工乙醇溶液清洗和刀片刮更干净、更方便；（2）TissueLyserⅡ高频破碎牙齿，破碎程度高且易控制污染；（3）经TissueLyserⅡ高频破碎获得的牙粉非常细，在经过两次重复的EDTA脱钙、ATL和PK裂解、QIAcube抽提过程，将两次抽提的牙粉DNA模板合并再浓缩，提高了DNA回收率和DNA的模板浓度。

综上，高度腐败组织裂解后用Investigator Lyse& Spin Baske试剂盒套管两次离心，可以极大限度地去除肌腱筋膜等有形物质和脂肪组织形成的油脂液层影响，提高模板DNA的纯度。降解、低拷贝的DNA模板用REPLI-g®Single Cell试剂盒纯化后扩增，可以提高STR分型成功率。对破碎程度高的极细牙粉提取DNA时，可重复脱钙、裂解、DNA提取等步骤，合并重复抽提收集的模板DNA后再浓缩，以提高DNA回收率。

［1］中华人民共和国公安部.人类DNA荧光标记STR分型结果的分析及应用：GA/T 1163—2014［S］.北京：中国标准出版社，2014.

［2］黄娅琳.高温烹饪对动物肌肉组织DNA降解的影响［J］.四川动物，2012，31（2）：222-225.

［3］凃政，刘志芳，陈松，等.牙齿的DNA提取及STR分型研究［J］.刑事技术，2007，（5）：9-11.

［4］骆继怀，孙红兵，杨鑫，等.人骨骼及牙齿DNA提取方法的比较和优化［J］.中国法医学杂志，2014，29（5）：467-469，476.

（本文编辑：柳燕）

DF795.2

B

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.05.014

1004-5619（2016）05-0378-02

汪三存（1976—），男，主检法医师，主要从事法医

DNA研究；E-mail：wsc1976@sina.com

（2015-10-13）