溺死大鼠肺组织AQP-1、AQP-4的表达

赵兵，姚士强，郝小惠

（1.唐山市公安局法化大队，河北唐山　063000；2.华北理工大学医学实验研究中心，河北唐山　063000）

溺死大鼠肺组织AQP-1、AQP-4的表达

赵兵1，姚士强1，郝小惠2

（1.唐山市公安局法化大队，河北唐山063000；2.华北理工大学医学实验研究中心，河北唐山063000）

目的观测生前溺死与死后抛入河水中大鼠肺组织水通道蛋白-1（aquaporin-1，AQP-1）、AQP-4的表达变化。方法将30只健康雄性Wistar大鼠随机分为河水溺死组、抛尸入水组及脱颈致死组。HE染色观察各组大鼠肺组织形态学变化，实时荧光定量PCR法检测各组大鼠肺组织AQP-1、AQP-4 mRNA的表达，免疫组织化学、Western印迹法检测其蛋白表达。结果免疫组织化学法和Western印迹法检测河水溺死组AQP-1蛋白的表达高于抛尸入水组和脱颈致死组（P〈0.05）。免疫组织化学法显示河水溺死组AQP-4蛋白的表达高于抛尸入水组和脱颈致死组（P〈0.05），而Western印迹法未检测出三者的差别（P＞0.05）。河水溺死组大鼠肺组织的AQP-1、AQP-4 mRNA表达高于抛尸入水组（P〈0.05）。结论河水溺死组的大鼠在急性肺损伤时肺组织AQP-1、AQP-4 mRNA及蛋白表达增高可能对生前溺死与死后抛尸的鉴别有一定意义。

法医病理学；溺水；水通道蛋白质-1；水通道蛋白质-4；大鼠

在溺死案例的法医学鉴定中，由于水中尸体的个体差异及实际情况的复杂性，在法医实践中有时难以在尸体检验中发现特征性病理改变。虽然肺表面活性物质相关蛋白A［1］、组织硅藻检测等相关实验室检测手段可提高对溺死鉴定的准确性［2］，但溺死的鉴定仍然是法医鉴定工作中的难点之一。尸体检验与实验室相关检测相结合是目前提高溺死鉴定准确率的有效途径［3］，因此寻找和探索与溺死相关的实验检测指标可以为提高溺死鉴定的准确率提供帮助。

水通道蛋白（aquaporin，AQP）是哺乳动物细胞膜上的特异性水转运蛋白家族，目前认为AQP-1、AQP-3、AQP-4、AQP-5等在肺毛细血管间的水转运中发挥着重要作用［4］，其中AQP-1、AQP-4在急性肺损伤的早期即可出现变化［5-6］，可望在生前溺死与死后抛尸入水的鉴别中发挥作用。本研究旨在探讨河水中溺死大鼠肺组织AQP-1、AQP-4的表达变化，为溺死的鉴别提供一定的基础研究数据。

1　材料与方法

1.1.1实验动物

SPF级健康雄性Wistar大鼠30只，体质量200～220g，购自天津山川红实验动物科技有限公司，动物许可证编号：SCXK（津）2009-0001。

1.1.2试剂和仪器

取自唐山市陡河胜利桥段的河水。Trizol Reagent总RNA提取试剂盒、逆转录反应试剂盒和SYBRGreen qPCR反应试剂盒（美国Promega公司），兔源性AQP-1多克隆抗体、兔源性AQP-4多克隆抗体（美国Santa Cruz生物技术有限公司），通用型SP免疫组织化学试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司），超敏ECL化学发光试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所）。化学发光成像系统（美国BioRAD公司），Rotor-Gene 3000型实时荧光定量PCR仪（德国QIAGEN公司），Image-pro plus 5.0图像分析软件（美国Media Cybernetics公司）。

1.2方法

安徽省传统农区宿州市埇桥区，过去农民习惯于分散种养，难以抵御自然风险和市场风险。2012年以来，埇桥区创建以“农业企业为龙头，家庭农场为基础，农民合作社为纽带”的现代农业产业化联合体，把单个的农业经营主体联结成利益共同体和产业化链条，形成具有综合竞争力的“农业航母”，在融合发展中取得“1+1+1＞3”的聚变效应。

1.2.1动物分组

将大鼠随机分为河水溺死组、抛尸入水组和脱颈致死组，每组10只。

1.2.2模型的建立及取材

河水溺死组：在室温23℃的条件下，将大鼠放入有机玻璃材料制成的有盖水箱（50 cm×70 cm×60 cm）中，箱中放置河水，并使水位达到距离水箱顶部5cm处盖上水箱盖并开始计时，至动物溺死沉入箱底的时间作为动物的溺死时间（平均13min）。

抛尸入水组：采用脱颈处死大鼠后，立即放入相同河水中浸泡13min。

脱颈致死组：作为对照，采取脱颈致死，但不投入水中。

所有大鼠均取右肺上叶做石蜡切片，左肺上叶肺组织置液氮中冷冻保存待用。

1.2.3 HE染色

大鼠肺组织经固定、包埋后制成切片，常规进行脱蜡、水化后，行苏木素-伊红（hematoxylin and eosin，HE）染色，观察大鼠肺组织的病理学改变。

1.2.4免疫组织化学染色

将组织切片行脱蜡、水化处理后，高压修复抗原，用3%过氧化氢溶液消除内源性过氧化酶，血清封闭后各组切片分别加入兔源性AQP-1、AQP-4多克隆抗体（均为1∶100稀释），4℃过夜后加入兔二抗，经二氨基联苯胺兰（digital audio broadcasting，DAB）显色，光镜下观察。AQP-1、AQP-4的阳性反应产物均呈棕黄色。应用Image-Pro Plus 5.0图像分析系统，每张切片取3个高倍视野（400×），并测量每个视野中的阳性表达区域细胞的光密度值，取3个高倍视野的平均光密度，代表该动物肺组织AQP-1、AQP-4的蛋白表达强度。

1.2.5 Western印迹法检测

每个样本取50 mg冷冻保存的左肺上叶边缘肺组织，提取蛋白后使用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法定量总蛋白，各样本取50 μg用质量分数为12%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，并将蛋白转印于醋酸纤维素膜上，分别用AQP-1、AQP-4多克隆抗体按1∶500稀释后孵育，4℃过夜，用相应的二抗稀释后室温孵育2h，ECL液显影，用化学发光成像系统扫描图像。内参蛋白为β型肌动蛋白（β-actin），分别将各组AQP-1、AQP-4和β-actin的条带灰度比值进行AQP-1、AQP-4的定量比较。

1.2.6实时荧光定量PCR法

取冷冻保存的左肺上叶肺组织40mg，用Trizol试剂盒提取总RNA并测定其浓度；应用逆转录试剂盒合成cDNA后应用AQP-1、AQP-4的引物分别进行实时荧光定量PCR，甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate，GAPDH）作为内参照。各基因的引物片段序列如下，AQP-1：5′-ACCCGCAACTTCTCAA ACCAC-3′，3′-ACCCGCAACTTCTCAAACCAC-5′，扩增片段141 bp；AQP-4：5′-GGCAGCAAGATAATGG ACCAC-3′，3′-CTACCTCAGAATACGCCCGTG-5′，扩增片段143 bp；GAPDH：5′-GCAAGTTCAACGGCACA GTCA-3′，3′-CGCCAGTAGACTCCACGACATA-5′，扩增片段141bp。采用二步法扩增，反应条件：95℃15s，60℃20s，循环次数为40次。应用ΔΔCt法对目的基因PCR产物进行相对量的分析比较，以脱颈致死组的AQP-1、AQP-4产物量为基准，计算各组产物的相对量。

1.3统计学分析

所有数据应用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。数据均以±s表示，计量资料经正态分布检验，符合正态分布者均数间两两比较采用LSD法；不符合正态分布者均数间两两比较采用Dunnett’s T3法。检验水准α=0.05。

2　结果

2.1 HE染色结果

HE染色可见，河水溺死组大鼠肺间隔增宽，肺泡壁毛细血管高度扩张、充血，部分肺泡腔可见渗出液以及红细胞，部分肺泡腔扩张、肺泡壁断裂呈肺气肿表现；抛尸入水组大鼠肺泡壁毛细血管可见轻度扩张，少量红细胞渗出，少量肺泡融合形成大泡，少见肺泡腔溢出液；脱颈致死组未见明显异常（图1）。

2.2免疫组织化学染色结果

大鼠肺组织中AQP-1免疫组织化学反应阳性产物的表达主要位于肺间质支气管的上皮、细支气管旁小血管内皮、毛细血管内皮及肺泡上皮细胞（图2）。各组AQP-1表达的平均光密度值见表1。结果显示，河水溺死组的AQP-1表达高于抛尸入水组和脱颈致死组（P〈0.05），抛尸入水组和脱颈致死组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

AQP-4阳性产物主要分布于大小支气管上皮、肺泡上皮细胞等部位（图3）。各组大鼠AQP-4表达的平均光密度值见表1。结果表明，河水溺死组的AQP-4表达也高于抛尸入水组和脱颈致死组（P〈0.05），抛尸入水组和脱颈致死组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1　大鼠肺组织AQP-1、AQP-4免疫组织化学表达的平均光密度值（n=10，±s）

表1　大鼠肺组织AQP-1、AQP-4免疫组织化学表达的平均光密度值（n=10，±s）

注：1）与脱颈致死组比较，P〈0.05；2）与抛尸入水组比较，P〈0.05

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2.3 Western印迹法结果

AQP-1蛋白表达的Western印迹法检测结果与免疫组织化学检测一致，即河水溺死组AQP-1蛋白的表达量与抛尸入水组和脱颈致死组相比表达增高，差异有统计学意义（P〈0.05），而抛尸入水组和脱颈致死组相比，AQP-1蛋白的表达量差异无统计学意义（P＞0.05，图4）。

对于AQP-4而言，Western印迹法检测蛋白的表达量在三组之间差异无统计学意义（P＞0.05，图4）。

2.4实时荧光定量PCR检测结果

河水溺死组大鼠肺组织AQP-1、AQP-4 mRNA的表达与抛尸入水组和脱颈处死组相比均明显增高，差异有统计学意义（P〈0.05），而抛尸入水组和脱颈处死组AQP-1、AQP-4 mRNA的表达差异无统计学意义（P＞0.05），结果见表2。

表2　各组大鼠肺组织AQP-1、AQP-4 mRNA的ΔΔCt值表达（n=10，±s）

表2　各组大鼠肺组织AQP-1、AQP-4 mRNA的ΔΔCt值表达（n=10，±s）

注：1）与脱颈致死组比较，P〈0.05；2）与抛尸入水组比较，P〈0.05

组别AQP-1 mRNAAQP-4 mRNA河水溺死2.547±0.5381）2）2.147±0.6391）2）抛尸入水1.175±0.3170.916±0.244脱颈致死1.000±0.0001.000±0.000

3　讨论

1991年，Preston等［7］发现了位于红细胞膜的疏水性跨膜蛋白质即水通道蛋白（AQP），在哺乳类动物体内总共发现了13种亚型（AQP0～AQP12）。AQP表达于多种上皮、内皮及其他组织上，能够帮助水在不同渗透梯度间跨膜转运［8］。研究［9］发现，AQP还可介导甘油、乳酸、嘌呤等中小分子的跨膜转运，AQP-0、1、2、4、5、6、8等主要介导水分子的跨膜转运。在呼吸系统中，主要有AQP-1、AQP-3、AQP-4、AQP-5、AQP-8等表达在呼吸道和肺组织［10］。其中，AQP-1主要分布于微血管内皮细胞、支气管周围血管床、气管黏膜上皮、淋巴管、胸膜和Ⅱ型肺泡上皮细胞［11］；AQP-4主要分布于大小气道上皮、肺泡内皮细胞、Ⅰ型肺泡上皮细胞、纤毛管及肺泡细胞的基底膜等处［4，12］。任何可引起肺损伤的因素均会导致上述指标的变化，尤其在急性肺损伤时［13］。

溺死指水或液体进入呼吸道，影响气体交换而引起的死亡。在法医学的死亡原因鉴定中，对于水中出现的尸体，首先需要鉴别的是生前溺死还是死后抛尸入水。溺水导致的水性肺气肿以及多个器官硅藻的检出是确定生前溺死的手段，但并不具备决定性的作用［14］。内陆城市多见河水中溺死尸体，因此，本研究选用市内河水利用大鼠制作溺死的模型，采用目前常用的分子生物学技术检测模型肺组织的AQP-1、AQP-4蛋白及mRNA的表达。本实验结果显示，河水溺死的大鼠肺组织AQP-1、AQP-4 mRNA的表达均高于抛尸入水组2倍以上，且AQP-1蛋白表达增高，在Western印迹法和免疫细胞化学检测中都得到了相同的结果；而AQP-4蛋白在免疫组织化学检测结果显示，河水溺死组阳性表达产物高于抛尸入水组，但Western印迹法检测结果提示两者差异无统计学意义。上述结果提示，溺液短时间迅速进入大鼠呼吸道，使局部水分迅速增多，影响肺部气体交换，导致肺部急性损伤，呼吸上皮等组织细胞缺氧水肿，肺内水的平衡被破坏、转运障碍，而AQP作为维持水转运的重要蛋白，应激性迅速生成增多以弥补水转运能力的不足。因此短时间内出现AQP-1、AQP-4在mRNA水平的增高。而抛尸入水的大鼠不会引起肺组织的AQP-1、AQP-4 mRNA的变化。同时，由于真核细胞核膜的存在，使得真核细胞基因的转录和翻译在不同的部位进行，蛋白的合成往往滞后于mRNA的变化。溺死往往发生在短时间内，因此本实验中AQP mRNA的变化相对明显。

本实验在AQP-4蛋白的检测中出现了免疫组织化学和Western检测结果不一致的现象，分析原因可能由于AQP-4蛋白主要表达于大小气道上皮、肺泡内皮细胞等，免疫组织化学的结果也显示阳性表达的区域在大小气道上皮更明显，在进行定量分析时大小气道的阳性表达更占优势，而Western印迹法选取肺边缘组织进行研磨提取肺组织总蛋白检测，由于短时间内溺亡组大鼠肺组织中AQP-4蛋白增加幅度较小，所以在总蛋白中比较其成分的变化不明显。AQP-1在微血管内皮细胞、支气管周围血管床、气管黏膜上皮、淋巴管等表达，定位广泛，含量相对较高，可能在病理情况下较其他类型的AQP发生变化更早，所以其在较短时间内的蛋白水平的微弱表达变化更容易捕捉到。AQP-4在蛋白水平的变化，也有待选择不同溺液、观察不同实验条件等来进一步验证。

关于AQP与溺死的研究较少，每个研究的溺液成分和具体实验条件也不尽相同，故所得结果也有差异。在法医学死因鉴定的实际案例中，往往案情复杂、混杂因素多样、尸体的状况相对复杂，需要考虑的因素众多，不能简单依靠某一个实验指标。本研究只是初步探讨了一定条件下建立的大鼠溺水动物模型的AQP-1、AQP-4蛋白及mRNA的表达变化，只应用了当地的河水这一种成分作为溺液，实验结果也是基于溺亡之后立即留取的较新鲜的组织，在众多的实际溺亡案件中，尸体在水中的状态往往更加复杂。在不同性质的溺液中上述结果是否一致，在溺死的人类标本中是否能得到同样的结论，还需设计更贴合实际情况的溺水模型进一步研究。另外，溺亡时除肺之外的其他组织器官中AQP表达情况也值得关注。还可以结合硅藻检测以及肺表面活性物质相关蛋白A等指标探索和明确AQP家族在溺亡案件中的鉴定价值和意义，给溺亡案件的鉴定提供更多线索和帮助。

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（本文编辑：黄平）

Expression of AQP-1 and AQP-4 in the Lungs of Drown Rats

ZHAO Bing1，YAO Shi-qiang1，HAO Xiao-hui2
（1.Forensic Science Brigade of Tangshan Public Security Bureau，Tangshan 063000，China；2.Medical Research Center，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000，China）

Objective To observe the changes of expression of aquaporin-1（AQP-1）and AQP-4 in drowned and postmortem immersed rats’lungs.Methods Thirty healthy male Wistar rats were randomly divided into drowning group，postmortem immersion group and cervical dislocation group.The morphological changes of rats’lungs were observed using HE staining.The mRNA and protein expressions of AQP-1 and AQP-4 in rats’lungs were detected by real-time PCR，immunohistochemistry and Western blotting，respectively.Results The results of immunohistochemistry and the Western blotting showed that the protein expression of AQP-1 of the drowning group was higher than the postmortem immersion group and the cervical dislocation group（P＜0.05）.The result of immunohistochemistry showed that the protein expression of AQP-4 of the drowning group was higher than the postmortem immersion group and the cervical dislocation group（P＜0.05）while no difference were detected among the three of them by Western blotting（P＞0.05）.The mRNA expressions of AQP-1 and AQP-4 in rats’lungs of the drowning group was significantly higher than the postmortem immersion group（P＜0.05）.Conclusion The increase of mRNA and protein expressions of AQP-1 and AQP-4 in lungs of rats with cute lung injury of the drowning group would be useful for differentiating vital drowning from postmortem immersion.

forensic pathology；drowning；aquaporin-1；aquaporin-4；rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2016.05.001

1004-5619（2016）05-0321-05

河北省科技厅科技支撑项目（10276116D）

赵兵（1971—），男，主要从事法医学现场勘验和法医病理学研究；E-mail：bingzhao_2012@163.com

郝小惠，女，硕士，教授，硕士研究生导师，主要从事呼吸系统疾病的研究；E-mail：haoxiaohui2005@163.com

（2014-08-27）