非图案化法制备柔性连续葡萄糖监测传感器

陈玮 陈裕泉

摘 要 以聚多巴胺作为前驱体，在聚酰亚胺薄膜表面化学沉积一层牢固致密的金层，以该镀金薄膜两面的金层作为基体电极，在其中一面镀铂黑作为参比对电极，在另一面依次电沉积铂黑层、电泳形成Nafion/碳纳米管网络层、电吸引形成葡萄糖氧化酶层构成工作电极，并整体涂覆聚氨酯外膜，制备了一种柔性葡萄糖传感器。考察了此传感器对葡萄糖的检测性能，以及各层表面形态结构对传感器性能的影响。传感器在0.3 V的工作电位下对葡萄糖的线性响应范围是2.0～32.0 mmol/L，响应灵敏度为25 μA·（mmol/L）

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Symbolm@@ 2，检出限为0.05 mmol/L （S/N=3），且传感器有良好的长期稳定性和抗干扰性，可用于皮下连续血糖监测。

关键词 表面金属化； 柔性传感器； 连续； 血糖

1 引 言

糖尿病是严重威胁人类健康的常见慢性病之一，目前仍无法治愈，但有效的血糖管理可以大幅降低并发症的发生率，提高患者生活质量。连续血糖监测系统（CGMS）的出现[1]，为血糖监控提供了完整的趋势信息，并能提供高、低血糖的报警功能，能将患者每日指血测量的次数降低到1～2次，甚至于无需指血校准[2]，是继指血血糖仪之后的又一重要发明。目前，这类传感器通常是以柔性聚合物薄膜为基底，在其上印刷碳电极或溅射金电极，通过电极的层层组装[3]或平面错位排布[4]形成电化学三电极体系；或者直接利用极细的金属丝制作[5，6]，以金属丝表面的绝缘层隔离工作电极与参比电极，形成二电极体系。但这些方法制作的传感器材料成本高，工艺复杂、规模化程度低，使得这类产品生产成本高，价格昂贵，制约了CGMS系统的推广应用。

近年来，仿生学研究发现，在水溶液条件下，多巴胺能发生氧化聚合，在聚合物、金属、陶瓷、玻璃、木材等一系列固体材料表面形成一层超强附着的复合层。而多巴胺的邻苯二酚基团能够对金属产生一定强度的束缚力，且对金属离子具有较强的还原能力，当表面沉积聚多巴胺层的改性材料浸入金属盐溶液中时，复合层从溶液中还原金属阳离子并使之沉积在材料表面，从而实现无电镀的材料表面金属化[7]。这是一种有别于光刻、丝网印刷、喷印、磁控溅射等技术的有机薄膜表面金属化方法，非常适合用于构建薄膜型电化学电极。本研究利用该技术，在聚酰亚胺（PI）薄膜表面化学沉积一层致密的金层，然后以薄膜两面的金层分别作为工作电极与参比对电极，构成电化学两电极体系，形成一种单层双面柔性薄膜电极。以此为基础，在设定的工作电极表面电沉积花瓣状铂纳米颗粒作为催化层；在碳纳米管（CNT）的Nafion分散液中电泳吸附CNT形成CNT/Nafion网孔结构，作为抗干扰层；并在其上通过电吸附葡萄糖氧化酶，形成酶生化敏感层；最后，在戊二醛中交联固化后涂覆聚氨酯（PU）传质限制层，构成葡萄糖检测传感器。制备的传感器表现出良好的葡萄糖连续检测性能，兼具柔性、微细、长期稳定性好、抗干扰性强的特点，而此制备方法具有原材料成本低，可成板制备，切割成型，易于实现规模化生产等优点，有望应用于低成本皮下连续葡萄糖监测传感器的开发中。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

CHI660E型电化学工作站（上海辰华公司）；Sirion100型场发射扫描电镜（荷兰FEI公司）；激光切割机（深圳立华激光公司）。

聚酰亚胺（PI）薄膜（Kapton 500HN，3M公司）；聚氨酯（PU）、Nafion（5%， w/V）、牛血清蛋白（BSA）、 多巴胺盐酸盐（Sigma公司）；十八烷基三甲基氯化铵（STAC，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；四氢呋喃（THF）、二甲基甲酰胺（DMF）、抗坏血酸（AA）、尿酸（UA）、醋氨酚（AP）、葡萄糖氧化酶（GOD，200U/mg）、葡萄糖、戊二醛（25% w/V）、氯铂酸、氯金酸、硼氢化钠、醋酸铅、H2O2（国药集团上海试剂公司）；碳纳米管水性分散液（7%～8%，w/V，中国科学院成都有机化学有限公司）；TrisHCl （pH 8.5）、0.01 mol/L PBS缓冲液（武汉博士德生物工程有限公司）；实验用水为去离子水；所有试剂均为分析纯。实验在室温下进行。

2.2 聚酰亚胺薄膜表面金属化

将清洁后的PI薄膜（10 cm × 4 cm）浸入多巴胺盐酸盐溶液（2 mg/mL，pH 8.5）中，室温下缓慢振荡24 h，使PI薄膜表面形成一层聚多巴胺（记为PI/DOPA）。将PI/DOPA片浸入STAC溶液（0.1%，w/V）中静置5 s后，迅速转移到铂纳米溶胶[8]中，1 min后取出晾干，使PI/DOPA表面静电吸附一层随机分布的铂纳米颗粒；然后浸入镀金液（含10 mmol/L氯金酸与20 mmol/L过氧化氢）进行化学沉积，5 min后取出并在200℃烘箱中退火5 min，使聚酰亚胺薄膜表面形成一层光亮致密的金层（记为PI/Au）。

2.3 传感器制备

设定工作区域为5 mm，引线部分为1 cm，其余部分为绝缘区域（3.5 cm），在PI/Au两面设定的绝缘区域气相沉积Parylene（记为PI/Au/Parylene）。然后以Pt片为对电极，用恒电位法，设定工作电位

Symbolm@@ 2.5 V，沉积时间120 s，在设定的工作区域电沉积铂黑层（记为PtPt），其中，镀铂液为3%（w/V）氯铂酸和0.25%（w/V）醋酸铅的混合溶液；接着，在CNT/Nafion混合溶液（1∶4， V/V）中，以R面作为对电极，W面为工作电极，用恒电位法，设定工作电压为1.0 V，工作时间90 s，在W面上电泳吸附CNT，形成以CNT为骨架的Nafion网络层（记为Pt/CNTPt）。然后，同样用恒电位法，设定工作电压为0.7 V，工作时间20 min，在GOD溶液（含10wt%的BSA）中，将GOD电吸附于W面，接着在4℃冰箱中干燥8 h，使GOD充分嵌入到CNT网络层内.然后，在40℃烘箱中，将W面悬挂于底部含25%戊二醛的密封腔中进行交联，40 min后取出并置于4℃冰箱中保存8 h，使酶层充分交联固化（记为Pt/CNT/GOxPt）。然后用激光切割机将薄膜切割成0.5 mm×4 cm的细针状，其中工作区域为0.5 mm×5 mm。最后，让针型传感器的工作区域缓缓穿过沾有4%（w/V）PU溶液（THFDMF，98∶2， V/V）的钢丝圈（=2 mm），在其表面形成一层多孔保护膜。涂膜后的传感器在干燥箱中干燥8 h后，在PBS溶液中浸泡72 h，使传感器各层充分调控融合。制备的传感器放在4℃保存备用。传感器制备示意图如图1所示。

2.4 葡萄糖连续响应测试

测试在CHI660E电化学工作站上进行，采用计时电流 （it） 法进行葡萄糖连续响应测试。设定工作电位0.3 V，磁子转速200 r/min，检测池内PBS溶液（0.01 mol/L，pH 7.2）温度37℃。上电初始化40 min后，每隔5 min，向检测池中注射适量浓度葡萄糖溶液，使检测池中的葡萄糖浓度按4 mmol/L的梯度递增。

3 结果与讨论

3.1 传感器各层表面形态表征

利用扫描电镜观察各层表面形态。图2a是PI镀金薄膜横切面，金层厚约10 μm，与PI表面紧密结合。图2b是镀金层表面，可观察到整齐、紧致、均匀分布的金纳米颗粒。图2c是铂催化层，铂纳米颗粒呈花瓣状，单个花瓣平均长度400～500 nm，平均宽度150～250 nm。图2d是Nafion/CNT多孔网络层，可见Nafion以CNT为骨架，呈多孔网络结构状。图2e是葡萄糖氧化酶层，可看到GOx嵌入并覆盖Nafton/CNT网孔，形成一层多孔、厚实的酶层。图2f为PU外膜层，其中，PU呈多孔结构，孔径分布范围为2～4 μm。

3.2 传感器对葡萄糖的响应性能

传感器对葡萄糖的连续响应测试如图3所示，在最优条件下，传感器对葡萄糖响应的线性范围为2.0～32.0 mmol/L，相关系数r=0.98（图3左上插图），响应灵敏度为25 μA·（mmol/L）

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Symbolm@@ 2，检出限为0.05 mmol/L（S/N=3）。如此高的响应灵敏度一方面得益于催化层中花瓣状的铂纳米颗粒对H2O2有极强的电化学催化能力[10]，使酶层催化葡萄糖反应生成的H2O2迅速分解，从而产生较强响应电流；另一方面，铂纳米花层大大增加了电极的比表面积，从而产生更大的响应电流。

本传感器具有较快的响应速度，以葡萄糖浓度从8 mmol/L到12 mmol/L变化时为例，从注射高浓度葡萄糖至达到90%稳态响应值的用时24 s（图3右下插图），30 s内达到稳态响应值。考虑到每次从注射葡萄糖到检测池浓度达到均衡所花费时间的影响，单次浓度梯度变化的响应时间在25～35 s内。快速的响应速度既取决于Pt催化层对H2O2的快速响应能力，也取决于单层双面的传感器电极结构。工作电极与参比/对电极之间仅间隔一层PI膜，厚度仅127 μm，电极间如此近的距离，缩小了以O2扩散完成电子传递的距离，从而加快电子传递速度，获得较快的响应速度。然而，较小的电极间隙，也带来了电子在两极之间来回穿梭而形成的穿梭电流对响应的影响[3]，尤其是在较高的浓度梯度下，穿梭电流带来了较大的背景噪声。

3.3 一致性测试

随机挑选同一片PI膜经激光切割后的8根传感器，对比其涂覆PU膜前后，传感器的线性响应范围，如图4所示。从图4a可见，经激光切割后，传感器的批量一致性好，但受酶反应动力学米氏常数的限制，其线性响应范围小。经手工涂覆PU膜后，在PU传质限制膜的作用下，传感器的线性范围明显扩大，但由于实验条件限制，用手工完成涂膜，涂膜操作的速度，周边环境温湿度的轻微变化都可能影响成膜的效果，因此，出现了涂膜后传感器一致性变差的情况，如图4b所示。

3.4 抗干扰实验

对电活性物质的抗干扰性是决定葡萄糖传感器准确性的重要指标，为能直接考察传感器的抗干扰特性，对未涂PU传质限制层的传感器进行连续梯度测试。如图5所示，本传感器对尿酸（UA）、抗坏血酸（AA）、醋氨酚（AP）都有良好的抗干扰性，这是由于Nafion/CNT网络多孔内层，对传感器的抗干扰性起到积极的作用[11]，另一方面，本传感器工作电位低（0.3 V），大大降低了电极对抗坏血酸等电活性物质的响应，进一步提高了传感器的抗干扰性。

3.5 PU膜生物兼容性实验

植入皮下工作的葡萄糖传感器灵敏度会随着酶活性的下降， 传感器表面的蛋白吸附而下降。对涂有PU膜的传感器进行仿生理环境的体外测试结果如图6所示。在37℃水浴环境下，将传感器浸入胎牛血清中长期浸泡后，每隔一定时间取出进行葡萄糖连续响应测试，结果表明，浸泡3 d后，传感器的连续梯度响应性能比刚涂覆过PU膜的传感器性能略有提升，这是由于外层PU膜在连续浸泡后，传感器各层之间的调控更加连续一致。但浸泡15 d后，对36 mmol/L浓度时的最大响应电流约降为初始值的75%；浸泡30 d后，约降为初始值的65%。这可能是由于随着传感器长期在胎牛血清中的浸泡，PU表面多孔结构开始出现缓慢降解，促使蛋白吸附量逐渐增加，减少了传感器的有效面积所致。但此时的灵敏度仍达10 μA·（mmol/L）

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Symbolm@@ 2，可以满足连续监测的要求。

4 结 论

以表面化学镀金的PI薄膜为基体电极，成功制备了一种柔性细针状葡萄糖传感器，本传感器在2.0～32.0 mmol/L的线性响应范围内，灵敏度为25 μA·cm

Symbolm@@ 2·（mmol/L）

Symbolm@@ 1，在胎牛血清中连续浸泡30 d，响应信号约为初始状态的65%，适用于皮下连续葡萄糖监测。本传感器制备采用激光切割成型，易于实现规模化生产，后期可改进PU涂膜方式为机涂，提高传感器批量生产的一致性。

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