橡胶树红根病菌具有差异化的营养需求

杨先锋 徐正伟 华玉伟 李季 戴雪梅 辛士超 黄天带

摘 要 将分离自云南、海南两地的9株橡胶树红根病菌，分别在面粉培养基，MS培养基及二者各一半混合而成的培养基（1/2 MS）上培养，结果发现，其中7个菌株在1/2 MS上生长最佳，2个菌株在面粉培养基上生长最佳。同时，5个菌株在MS培养基上生长最慢，3个菌株在面粉培养基上生长最慢，一个菌株在1/2 MS培养基上生长较慢，这说明橡胶树红根病菌具有差异化的营养需求，而1/2 MS可以作为最有利于红根病菌生长的培养基。另外，病原菌在3种培养基上具有不同的形态特征，而且在1/2 MS培养基上最早出现黄化色变。

关键词 橡胶树红根病菌 ；培养基 ；营养需求 ；黄化变色

中图分类号 S794.1 ；S763.7 Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.04.014

Differential Nutrition Demand of Ganoderma pseudoferreum

YANG Xianfeng XU Zhengwei HUA Yuwei

LI Ji DAI Xuemei XIN Shichao HUANG Tiandai

（Rubber Research Institute / Ministry of Agriculture Key Laboratory of Rubber Biology，

Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences， Danzhou， Hainan 571737）

Abstract Nine Ganoderma pseudoferreum strains isolated from Yunnan and Hainan province were cultured on flour plate， MS plate and 1/2 MS plate（comprised by half flour and half MS） respectively. Then we found that seven strains grew best on 1/2 MS plate， the other two grew best on flour plate. Of the nine strains， there are five， three and one grew worst on MS， flour and 1/2 MS plate respectively，which indicate the differential nutrition demand of Ganoderma pseudoferreum. Moreover， the morphological character and yellow-changing of the strains were also affected by the different three cultures.

Keywords Ganoderma pseudoferreum ； culture ； nutrition demand ； yellowish-changing

伴随着我国天然橡胶种植面积及种植年限的增加，以及老胶园的更新复种，橡胶树根病的危害日趋严重[1]。在我国，橡胶树根病是危害橡胶树的重要病害之一，共有7种：红根病、褐根病、紫根病、臭根病、黑根病、黑纹根病和白根病，其中又以橡胶树红根病危害面积最广，危害程度最大[1-2]。发病树若不进行及时处理，会严重减少胶树的干胶产量，并最终导致胶树死亡，严重缩短胶林的生产寿命。据估计，仅海南农垦每年因为橡胶树红、褐根病危害造成的干胶损失就高达3 000多t[3]。

橡胶树红根病病原菌为橡胶树灵芝菌[Ganoderma pseudoferreum （Wakef） Over.et Steinm]，属担子菌，层菌纲，灵芝属[4]。相对于大多数可人工培养的植物病原真菌，橡胶树红根病菌在平板培养基上生长缓慢，速度不同步，且形状不规则，属于相对难培养的菌种，可能预示了病原菌生长营养需求的复杂性。课题组在前期的培养过程中发现，将分离自云南、海南两大植胶区的9个红根病菌株分别在3种培养基上生长，结果不同的菌株表现出了不同的培养基偏好性。除了生长速度的差别，不同的培养基还对菌丝的生长形态及颜色变化有影响。本研究的实施，将为筛选合适的红根病菌培养基，探寻病原菌的生理代谢途径，以及病害防控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

橡胶树红根病菌株由中国热带农业科学院橡胶研究所涂敏博士提供（经真菌rDNA-ITS测序，与NCBI上橡胶树红根病菌ITS序列完全匹配）。其中菌株SD1、SD2、SD4分离自海南省儋州市三队不同橡胶树林段的病树头，A03、A05分离自海南省琼中县大丰农场的不同林段，B01、DF、YN1分离自云南省景洪市不同的橡胶树农场，B04分离自云南省河口县的坝洒农场。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 面粉培养基

面粉30 g，葡萄糖20 g，琼脂粉17 g，加去离子水定容至1 L，充分摇匀溶解后分装三角瓶，121℃，21 min高温高压灭菌。

1.1.2.2 MS培养基

即为植物组织培养常用的诱导愈伤MS培养基稍加改良[5]。

1.1.2.3 1/2 MS培养基

将上述面粉培养基与MS培养基以1∶1的体积比混合而成。

1.2 方法

1.2.1 培养方法

各菌株在面粉培养基平板上于28℃活化培养。在活化平板同一直径圆周上取长势一致的0.5 mm见方的小菌块分别接种于3种培养基平板的正中央位置，每种培养基平板接3皿作为技术重复，然后于28℃培养箱黑暗培养[6]，7 d后用十字交叉法[7]测量记录菌落直径（cm），继续放置观察记录菌落的生长状态并拍照。实验进行3次生物学重复。

1.2.2 统计分析

每个技术重复的3个培养皿平板中菌落直径的平均值，作为当次实验每个菌株在相应培养基上生长速度的数值。最后，每个菌株在相应培养基平板上3次生物学重复的平均值，作为在相应培养基平板上生长速度的最终数值。数据统计分析用软件DPS完成。

2 结果与分析

2.1 不同菌株具有不同的培养基偏好性

如表1、图1所示，在3种培养基平板上培养7 d后，不同的菌落大小显示了各菌株对3种培养基的偏好性。

在全部9个菌株中，有7个菌株以1/2 MS为最适培养基（SD4，A03，A05，B01，DF，SD1，SD2）（图2A）。在这7个菌株中，有2个菌株以MS为最差培养基（SD4，A03）（图2A），有3个菌株以面粉为最差培养基（A05，B01，DF）（图2B），另2个菌株SD1、SD2 在MS和面粉培养基上生长速度相当（图2C）。

菌株YN1与B04在面粉培养基上生长速度最快（图2D）。其中，相对于其它菌株，B04在全部3种培养基上都是生长速度最慢的菌株，而且是唯一在1/2 MS培养基上生长较慢的菌株。

2.2 3种培养基对红根病菌的形态有影响

在各菌株长满平皿后，9株红根病菌在3种培养基上表现出了较一致的3种形态特征。虽然面粉培养基并不是大多数菌株生长最快的培养基，但菌株长满培养皿后，菌丝生长最致密、旺盛，长长的气生菌丝长满皿的四周、皿盖，甚至从皿缝中钻出。而在MS培养基上，菌丝稀疏，形态显得干瘪，形状呈车轮辐条辐射状生长，长满平皿后的菌丝量要少于面粉培养上的菌丝量。在1/2 MS培养基上的生长状态介于以上2种培养基之间（图3）。

2.3 三种培养基对红根病菌的黄化色变有影响

当红根病菌长满平皿并继续培养4周以上时，已进入黄化，并进一步褐化、革质化的色变衰老期。但是，所有菌株都是在1/2 MS培养基上最早出现黄化变色。除了菌株A05和A03，其余菌株都是在MS培养基上最晚出现或最不易出现黄化色变（图4）。

3 讨论

病原菌的分离培养是病原菌后续诸多生物学研究的基础。大多数可离体培养的植物病原真菌都可以在PDA培养基上很好地生长，但是橡胶树红根病菌属于例外，在PDA培养基上生长缓慢。以病菌的生长速度为标准，本实验中的1/2 MS培养基对供试9株红根病菌中的7株表现为最优培养基。这种结果很容易理解，因为1/2 MS培养基综合了面粉和MS两种培养基的成分，营养更为全面。但是，YN1与B04两个菌株却以面粉培养基为最优培养基，特别是B04，在1/2 MS培养基上的生长速度，只相当于在面粉培养基上生长速度的53%。另外，在以1/2 MS培养基为最优培养基的7株菌株中，SD4、A03在MS培养基上生长最慢，A05、B01和DF在面粉培养基上生长最慢。在3次生物学重复之间，同一菌株，在相同的培养基平板上测量出的直径大小可能不同，这是因为所用母本菌株的老化程度不同，对菌株的扩展速度有影响，但这不影响同一菌株在3种培养基上扩展快慢的趋势。综合以上结果，说明橡胶树红根病菌不同菌株间具有差异化的营养需求。

这种营养差异与地域无关。涂敏等[8]利用RAPD标记，对采集于云南和海南的18株橡胶树红根病菌进行遗传相似性聚类分析，结果表明，不同生态类型地区的菌株存在较大的遗传差异性，地理上隔离地区的病原菌各自具有相对独立的进化途径。彭军等[9]利用rDNA-ITS序列对采集于云南和海南的12株橡胶树红根病菌进行了分子系统鉴定，结果表明，12个菌株可能由2个类群组成。本研究中，在1/2 MS上生长最佳的7个菌株中，B01和DF采集于云南，SD1，SD2，SD4及A03，A05采集于海南，而这其中，采集于海南的A05与采集于云南的B01和DF又表现为在面粉培养基上生长相对较慢。由此可以看出，本研究中9株菌株间的营养差异划分跟地理区域来源并不相关。

植物病原真菌在不同培养基上生长状态不同是正常现象[10]。肖仲久等[11]研究发现，4个不同来源地的白术白绢病菌虽然在6种培养基上生长存在一定差异，但统一地表现为在Czapek培养基上生长较差，在不同培养基上菌株LA20生长相对较差。但在本研究中，在面粉培养基上，A05生长速度最慢，只相当于在面粉培养基上生长速度最快的YN1生长速度的1/3；在1/2 MS培养基上，生长速度最慢的B04只相当于生长速度最快的A03的24.7%；A03、SD4和YN1在MS培养基上生长相对较慢，A05、B01和DF在面粉培养基上生长相对较慢，SD1和SD2在面粉和MS培养基上生长速度差不多，这充分说明了橡胶树红根病菌株间营养代谢的差异和多样性。

红根病菌在1/2 MS培养基上最早出现黄化变色，其原因或许不能简单地归结为1/2 MS培养基相对为最适培养基，病原菌在上面的生长速度最快，所以才最早进入衰老期。因为菌株YN1和B04是以面粉为最优培养基，但2个菌株也是在1/2 MS培养基上最早出现黄化色变。而除了A05和A03，其余菌株都是在MS培养基上最晚出现或最不易出现黄化色变。由此推断，面粉培养基含有病原菌黄化色变过程中所需的大部分营养成分，而MS培养基含有少部分与面粉培养基互补的营养成分。菌落扩展速度与菌落颜色变化并没太大相关性，这与番茄早疫病菌不同[12]。当用平皿保存红根病菌时，为了延缓黄化色变，延长保存期，建议用MS培养基来保存。

由实验可知，在面粉培养基的基础上加入MS培养基，无论是对红根病菌的营养生长，还是对其形态及色变衰老都有重要的影响。说明MS培养基中的营养成分参与了红根病菌多方面的基础代谢。虽然本研究中的1/2 MS培养基可能还不是最适合橡胶树红根病菌的培养基，但是也为培养红根病菌提供了一种不错的培养基选择。通过单因子实验分析到底哪种营养元素参与了红根病菌的相关生理代谢过程，进而鉴定对红根病菌的生长有重要影响的营养成分及其参与的代谢通路，可以为通过化学药剂甚至分子手段防治橡胶树红根病菌奠定基础。

参考文献

[1] 王树明，张 勇，白朝良，等. 河口植胶区橡胶树根病发生特点及综合治理分析[J]. 热带农业科学，2014，34（2）：63-68.

[2] 白建相，王 涓，黄 林，等. 云南河口垦区橡胶树根