适合Pilidium lythri菌丝生长和产孢的培养基

张桂军　郭巍　毕扬　杨宝东　张伟　宗召莉

摘要

由Pilidium lythri引起的草莓褐色叶斑病是在草莓Fragaria×ananassa上发现的一种新病害。病原菌在PDA（马铃薯葡萄糖琼脂）培养基上生长速度慢，产孢量低。为了探讨不同培养基对P.lythri菌丝生长和产孢的影响，筛选适合该病原菌菌丝生长和大量产孢的培养基，本文比较了10种培养基对P.lythri生长和产孢的影响，结果表明，SPDA（添加1.2%草莓果汁的马铃薯葡萄糖琼脂）培养基可以促进P.lythri菌丝生长；CA（胡萝卜琼脂）培养基、V8培养基和TPDA（胰蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂）培养基则可以促进P.lythri大量产生分生孢子。

关键词

草莓褐色叶斑病； Pilidium lythri； 培养基； 菌丝生长； 产孢

中图分类号：

S 436.5

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018090

The culture medium suit for mycelial growth and spore

production of Pilidium lythri

ZHANG Guijun， GUO Wei， BI Yang， YANG Baodong， ZHANG Wei， ZONG Zhaoli

（Beijing Key Laboratory of New Technology in Agricultural Application， National Demonstration Center for

Experimental Plant Production Education，Beijing University of Agriculture， Beijing 102206， China）

Abstract

Pilidium lythri tanbrown leaf spot of strawberry was a new disease in China. In previous studies， the widely used PDA medium had low mycelial growth rate and low yield of spores.In order to select the optimal medium for P.lythri，the effects of ten culture media that based on PDA medium on the mycelial growth and sporulation of P.lythri were compared. The results showed that SPDA （strawberry potato dextrose agar） medium can promote P.lythri mycelial growth， CA （carrot agar） medium， V8 medium and TPDA （tryptone） medium can promote P.lythri to produce conidia in large quantities.

Key words

tanbrown leaf spot of strawberry； Pilidium lythri； medium； mycelial growth； spore production

Pilidium lythri是国内外报道危害草莓的又一种病原真菌[1]。该病原菌首次在日本发现危害草莓，之后在波兰、巴西、比利时、美国和伊朗等地也有报道[26]，国内目前仅在北京地区发现该病菌危害草莓[7]。该病害发病初期在叶片中央或边缘形成圆形、水浸状、褐色病斑，后期病斑逐渐扩大，褐色至黑褐色，中间灰白色，边缘淡褐色，潮湿条件下病部产生橘红色团状黏质小点。果实症状初期为浅褐色腐烂，后期可导致全果腐烂，腐烂部位产生红色团状黏质颗粒状物[8]。

除草莓外，P.lythri还可侵染油橄榄Olea europaea[9]、虎杖Fallopia japonica[10]、草甸水兰Hieracium caespitosum[11]、厚叶岩白菜Bergenia crassifolia[12]、牡丹Paeonia suffruticosa[13]、桉树Eucalyptus sp.[14]、玫瑰Rosa rugosa[15]、欧洲李Prunus domestica[16]、芍藥Paeonia lactiflora[17]等，造成黄褐色、深褐色相间的同心轮纹，天气潮湿时，病部可见橙红色或红褐色的小颗粒[17]。目前，关于P.lythri的生物学特性研究较多，主要采用PDA培养基对其进行培养，但一般需要培养7 d菌落直径才能达到5 cm左右，而且产孢量较少，存在P.lythri生长速度慢、孢子产量不够用于开展相关研究等问题。针对上述问题，本研究采用了10种真菌培养基进行研究，旨在探索更适于P.lythri病菌菌丝生长和大量产孢的培养基，为后续该病菌的生物学特性、致病机制等研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

分别于2015年和2017年从北京市昌平区小汤山、湖南省娄底市和山东省诸城市采集草莓病叶，经常规组织分离、单孢纯化[18]，获得的病原菌纯培养物，编号分别为BJ4、HNLD7、HNLD12、SD176和SD1710。菌株ITS序列的测序工作由北京六合华大基因科技有限公司完成，将测序结果在NCBI上进行序列比对，并结合病原菌形态学观察、柯赫氏法则验证后确定为草莓褐色叶斑病菌P.lythri，保存于北京农学院植物保护实验室。

1.2 供试培养基

PDA培养基： 将200 g去皮的马铃薯切块，煮30 min至软烂，4层纱布过滤后，加入20 g葡萄糖和20 g琼脂粉定容于1 L水中，于121℃高压湿热灭菌20 min。

YDA培养基：酵母粉5 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，定容于1 L水中，于121℃高压湿热灭菌20 min。

SPDA培养基：将200 g去皮的马铃薯切块，煮30 min至软烂，4层纱布过滤后，加入20 g葡萄糖，20 g琼脂粉，加入120 mL鲜榨草莓汁定容于1 L水中，于121℃高压湿热灭菌20 min。

YPDA培养基： 将200 g去皮的马铃薯切块，煮30 min至软烂，4层纱布过滤后，加入20 g葡萄糖，20 g琼脂粉，5 g酵母粉定容于1 L水中，于121℃高压湿热灭菌20 min。

CPDA培养基：将200 g马铃薯同100 g胡萝卜去皮、切块，煮30 min至软烂，4层纱布过滤后，加入20 g葡萄糖，20 g琼脂粉定容于1 L水中，于121℃高压湿热灭菌20 min。

CA培养基：200 g胡萝卜榨汁后过滤，加入20 g琼脂定容于1 L水中，于121℃高压湿热灭菌20 min。

TPDA培养基：将200 g马铃薯去皮、切块，煮30 min至软烂，4层纱布过滤后，加入20 g葡萄糖，20 g琼脂粉，2 g胰蛋白胨定容于1 L水中，于121℃高压湿热灭菌20 min。

2P2DA培养基：将400 g马铃薯去皮、切块，煮30 min至软烂，4层纱布过滤后，加入40 g葡萄糖，20 g琼脂粉，2 g胰蛋白胨定容于1 L水中，于121℃高压湿热灭菌20 min。

P2DA培养基：将200 g马铃薯去皮、切块，煮30 min至软烂，4层纱布过滤后，加入40 g葡萄糖，20 g琼脂粉定容于1 L水中，于121℃高压湿热灭菌20 min。

V8培养基：V8蔬菜汁200 mL，加碳酸钙3 g，琼脂粉20 g定容于1 L水中，于121℃高压湿热灭菌20 min。

1.3 不同培养基对病原菌菌丝生长影响测定

1.3.1 菌丝生长速率的测定

打取直径5 mm的草莓褐色叶斑病菌菌饼，分别接种于PDA、YDA、SPDA、YPDA、CPDA、CA、TPDA、2P2DA、P2DA和V8培养基上，25℃黑暗培养7 d，采用十字交叉法测量菌落直径，数据采用SPSS软件中的最小显著差异法进行统计分析。每菌株每种培养基3次重复，试验重复2次。

1.3.2 菌丝干重的测定

选择1.3.1中菌丝生长量较大的培养基配方进行菌丝干重的测定。在不同培养基平板表面铺放灭菌玻璃纸，接种菌饼后于25℃黑暗培养7 d，刮取菌丝，烘干，测量菌丝干重，数据采用SPSS软件中的最小显著差异法进行统计分析。

1.4 不同培养基对病原菌产孢量影响测定

打取直径5 mm的草莓褐色叶斑病菌菌饼，分别接种于PDA、YDA、SPDA、YPDA、CPDA、CA、TPDA、2P2DA、P2DA和V8培养基的平板上，25℃黑暗培养8 d。采用直径5 mm的打孔器分别从上述培养平板中心接菌处向外依次辐射状打取一定数量的菌饼，并记录打取的菌饼数，置于加有10 mL无菌水（添加0.1%吐温20）的离心管中，加入5～8粒灭菌玻璃珠，振荡2 min洗脱孢子，用血球计数板计算孢子数，每处理重复3次，计算每平方厘米的孢子数量，并采用SPSS软件中的最小显著差异法进行统计分析，试验重复2次。

2 结果与分析

2.1 不同培养基对菌丝生长速率的影响

草莓褐色叶斑病病菌BJ4、HNLD7、HNLD12、SD176和SD1710在PDA、YDA、SPDA等培养基上，于25℃恒温条件下培养，7 d后测定菌落直径，结果表明，5株供试菌株在SPDA培养基上生长最快，其菌丝生长速率最大，为0.87 cm/d，其次在P2DA、CPDA、TPDA、2P2DA和CA培养基上生长也较快，V8和YDA培养基上生长较慢，其中以在V8培养基上生长最慢，菌丝生长速率最小，为0.63 cm/d（表1）。

2.2 不同培养基对菌落生长形态的影响

如图1～图5所示，5株供试菌株在PDA、YDA、SPDA、TPDA和V8培养基上生长的菌落厚实，菌丝浓密，边缘整齐，尤其是在SPDA培养基上生长快，2～3 d即可形成肉眼看见的菌落，中央菌丝茂密、隆起；供试菌株虽然在YPDA、CPDA、CA、2P2DA 和P2DA培养基上生长也较快，但是在YPDA、CPDA、CA和2P2DA培养基上菌丝生长稀疏；在P2DA培养基上虽然菌落呈圆形，边缘整齐，但几乎没有菌丝。

2.3 不同培养基对菌丝干重的影响

选择上述菌株培养性状较好的PDA、YDA、SPDA、TPDA和V8培养基进行菌丝干重的测定，结果如表2所示，供试菌株经SPDA培养基培养后收集到的菌丝量最多，菌丝干重最大，为145.5 mg，其次为TPDA培养基，5株供试菌株在V8培养基上生长后获得的菌丝量最少，仅为12.1 mg。结合不同培养基对草莓褐色叶斑病菌菌丝生长情况以及菌丝干重的影响，结果表明，SPDA培养基在菌丝生长速度、菌丝厚度及菌丝干重方面均为供试培养基中最适合供试菌株BJ4、HNLD7、HNLD12、SD176和SD1710生长的培养基。

2.4 不同培养基对产孢量的影响

将5株供试菌株接种于不同培养基平板上，培养8 d后测定产孢量，结果如表3所示，不同菌株其最适于产孢的培养基存在差异。CA培养基适于供试菌株BJ4产孢，产孢量为39.89×104个/cm2；TPDA为供试培养基中菌株SD176和SD1710单位面积产孢量最高的培养基，产孢量最大为9.32×104个/cm2；菌株HNLD7和HNLD12在V8培养基上的产孢最多，产孢量最大为21.12×104个/cm2。所有供试菌株在PDA和YDA培養基上产孢最少，产孢量最少仅为0.28×104个/cm2。

3 討论

2012年在北京市昌平区兴寿镇日光温室中首次发现的由Pilidium lythri引起的草莓褐色叶斑病是在草莓上发现的一种新病害[7]。草莓褐色叶斑病菌P.lythri为丝分孢子真菌，主要危害草莓的下部叶片，也可引起果实腐烂。目前，关于P.lythri的生物学特性研究较多，Zhang等[19]首先报道了P.lythri在河南洛阳可以侵染牡丹，引起牡丹红点病，并对该病的症状、病原菌特征及其生物学特性等做了比较详细的描述。已有的研究是采用PDA培养基对P.lythri进行培养[20]，但其一般需要培养7 d才能长至5 cm左右，而且产孢量较少，存在P.lythri生长速度慢、孢子产量不够开展相关研究所用的问题。

本试验以采自北京市昌平区小汤山、湖南省娄底市和山东省诸城市的P.lythri菌株BJ4、HNLD7、HNLD12、SD176和SD1710为供试菌株，分别测定了PDA、YDA、SPDA、YPDA、CPDA、CA、TPDA、2P2DA、P2DA和V8培养基对5株供试菌株菌丝生长和产孢量的影响。通过对多种培养基的筛选发现，在菌丝生长速度、菌丝厚度及菌丝干重方面SPDA均为供试培养基中最适合所有供试菌株生长的培养基，7 d后菌落直径可达6.09 cm，大于文献报道的PDA培养基上的菌落直径（4.80 cm）[20]，菌丝干重是常用PDA培养基的4倍。该培养基在配制过程中方便、简单，可以较好地促进草莓褐色叶斑病菌P.lythri菌丝生长，提高菌丝量，极大地改善了传统培养中使用PDA培养基进行培养的生长慢，菌丝偏少的缺点，可实现P.lythri的快速培养，且产生的大量菌丝提高了该病菌分子生物学相关研究的工作效率。

段亚冰等报道，最有利于P.lythri菌丝生长及产孢的碳源为葡萄糖，氮源为酵母膏，最适温度是25～30℃，在pH6～11范围内该菌均能生长和产孢，光照对菌丝生长和产孢无显著影响[20]。本试验采用25℃黑暗培养，通过对供试菌株在不同培养基上的产孢量测定发现，经pH处于中性的CA、V8和添加有胰蛋白胨的TPDA培养基培养的5株供试菌株的平均产孢量分别为11.43×104个/cm2、57.23×104个/cm2和8.76×104个/cm2，要远远大于添加酵母的YDA（产孢量为1.25×104个/cm2）和YPDA培养基（产孢量为2.55×104个/cm2），因此我们推测P.lythri的菌丝生长及产孢更需要碳源。此外，本试验研究发现，不同菌株其最适产孢的培养基也存在差异，采自北京的P.lythri菌株BJ4在CA培养基上产孢量最大；TPDA培养基最适于采自山东的菌株SD176和SD1710产孢；V8培养基则适于采自湖南的菌株HNLD7和HNLD12产孢。而所有的供试菌株在PDA和YDA培养基上产孢量是最少的。因此，CA、V8和TPDA培养基可用于促进P.lythri的大量产孢，为该病菌的后续研究提供材料。

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（责任编辑：田 喆）