关于纳米硅佐剂对新城疫抗原HI效价影响的研究

余佳璠

（惠州市惠城区动物卫生监督所，广东惠州 516001）

关于纳米硅佐剂对新城疫抗原HI效价影响的研究

余佳璠

（惠州市惠城区动物卫生监督所，广东惠州 516001）

以硅溶胶为佐剂制备了纳米硅佐剂新城疫疫苗。并考察了其与普通新城疫冻干苗，新城疫商品油苗的新城疫抗原HI效价的比较。结果表明它的效价比普通冻干苗的效价更高，持续的时间更长。与油苗相比它的黏度更低，制作成本也更廉价。本工作为纳米硅作为疫苗佐剂提供了基础数据。

新城疫；纳米硅佐剂疫苗；普通冻干苗；商品油苗；抗体效价

新城疫是多种家禽共患的重大动物疫病，分布广泛，传播快，对养禽业的危害十分严重［1］。我国目前使用的疫苗主要是灭活油佐剂疫苗和冻干苗（弱毒苗），为有效控制新城疫的流行发挥了重要的作用。但是和其它兽用油乳剂疫苗一样，油佐剂疫苗产生抗体速度较慢，而且由于其黏度过高，注射不方便，机体吸收也比较慢，只能在7日龄后使用，且成本高；而弱毒苗的安全性能差，有潜在散毒风险。因此寻找一种注射方便，稳定性好且能长久储存的新型疫苗，用于新城疫的紧急预防接种具有重要的现实意义。

纳米粒子一般是指粒径在1～100 nm范围内的超微粒［2，3］。纳米技术是指在1～100nm的量度范围内研究原子、分子的结构及相互作用并加以应用的技术［4］。纳米粒子具有比表面积大、表面活性中心多、反应活性高、吸附和催化能力强的特点，因此会产生体积效应、表面效应、量子尺寸效应、宏观量子隧道效应［5］。Kreuter等于1981年首次将纳米材料应用于疫苗佐剂［6］。纳米材料用作疫苗佐剂，使抗原结构更稳定［7］。纳米材料用作疫苗佐剂，已受到极大重视［8-11］。纳米佐剂是一类新型佐剂，必将成为一种理想的替代常规佐剂的新型佐剂［12］。

目前用于实践的主要纳米佐剂为纳米铝佐剂。它的主要优点在于它的有效性和安全性，且纳米粒子均匀性好［13］。

最近几年来，纳米二氧化硅因其在药物载体方面的应用受到了广泛关注。它的优点主要体现在：①纳米二氧化硅材料无毒，具有较好的生物相容性；②制备简单，价格低廉；③载药纳米二氧化硅具有缓慢释放药物的特点，可以作为缓释药物。

硅溶胶是纳米二氧化硅在水中的稳定分散体系，具有良好的分散稳定性好。因此本文选择纳米硅溶胶作为佐剂制备了新城疫疫苗。该疫苗呈半透明状，黏度低，并可以长期保存，不易发生沉淀现象。并考察了其与冻干苗和油苗产生抗体效价的比较，比较它们在同样的条件下对动物机体产生免疫力的效果。分别比较它们在单一免疫时和联合免疫后产生的抗体效价，判断纳米硅佐剂疫苗是否存在它的优势，为纳米硅作为疫苗佐剂提供一些基础数据。

1 材料与方法

1.1 实验设备

96孔V型反应板，25μl的微量移液器，微量振荡器，恒温培养箱，离心机。

1.2 纳米硅佐剂疫苗样1、样2

样1用20nm的纳米硅佐剂和样2中所用佐剂为15nm的纳米硅佐剂。实验中保证每一头份所含抗原量相等。

1.3 新城疫冻干苗

新城疫冻干苗（20120617，青岛易邦）由惠城区动物疫病预防控制中心提供。新城疫油苗（20120617）由青岛易邦生物工程有限公司提供。

1.4 试验用鸡

购自金种种鸡场1日龄spf鸡苗240只，试验时间2012年8月2号至2012年10月2号

1.5 试验用鸡的处理情况

试验用鸡分别分为七组每组60只。第一组为空白对照组，3日龄时每只在颈背部皮肤注射生理盐水0.5 ml/只；第二组为基础免疫组，3日龄时每只在颈背部皮肤注射新城疫冻干苗0.5 ml/只；第三组为纳米硅佐剂疫苗样1组，3日龄时每只在颈背部皮肤注射样1溶液0.5 ml/只；第四组为纳米硅佐剂疫苗样2组，3日龄时每只在颈背部皮肤注射样2溶液0.75 ml/只；第五组为基础免疫与样1的联合免疫组，3日龄时每只在颈背部皮肤注射新城疫冻干苗0.5 ml/只，在7日龄时再每只在颈背部皮肤注射样1溶液0.5 ml/只；第六组为基础免疫与样2的联合免疫组，3日龄时每只在颈背部皮肤注射新城疫冻干苗0.5 ml/只，在7日龄时再每只在颈背部皮肤注射样2溶液0.75 ml/只；第七组为基础免疫与油苗的联合免疫组，3日龄时每只在颈背部皮肤注射新城疫冻干苗0.5 ml/只，在7日龄时再每只在颈背部皮肤注射新城疫油苗0.5 ml/只。在7日龄时从前四组每组中抽取5只鸡进行采血，分离血清，用血凝抑制（HI）实验测其抗体水平，取平均值记录即为其抗体效价。以后每隔4天从每组中抽取5只鸡进行采血（测一个半月时间），分离血清，用血凝抑制（HI）实验测其抗体水平，取平均值记录即其抗体效价。在对试验动物注射疫苗后的两天内，应观察试验动物是否有应激或过敏反应，是否正常采食，并称重观察其是否正常生长。称重时每天在同一时间从每组取三只试验动物进行称重，取平均值记录。

1.6 4 个血凝单位病毒的制备

采用微量血凝试验测出病毒液的血凝价，再算出 4 个血凝单位病毒的稀释倍数。

操作方法：用定量稀释器于V 型微量凝集板的每孔中加入PBS液 25μL，共加 4 排孔。用稀释器分别取病毒液 25 μL至第一排和第三排的第一孔，混匀后，依次作倍比稀释至第二排和第四排的第四孔，最后弃去 25μL，第五孔作对照用。用稀释器吸取1% 鸡红细胞悬浮液依次加入各孔，每孔25μL. 振荡摇匀后，静置温箱（37℃）内反应15 min 后，以出现完全凝集的病毒最大稀释度为该病毒液的血凝价。3 次重复，取其平均值即为其血凝效价。若血凝价为n，则下次测抗体时该抗原所需稀释的倍数为2的n次方除以4。

1.7 1 %红细胞悬液的制备

采取健康青年公鸡的血液加于盛有抗凝剂的离心管内，用 20倍量的 PBS 液洗涤血球，反复洗涤 3～4次，每次以2000 rpm 离心 5 min后弃去上清液，最后一次离心 10 min。吸取压积红血球用PBS 液配制成1 %的红细胞悬液。

1.8 血凝抑制（H I）试验

采用常规 B2微量法，在 96 孔V 型微量凝集板上进行，用定量稀释器加样和稀释。先用稀释器取PBS液 25 μL加入每排各孔，第十二孔加50 μL，再取待检血清 25 μL加入第一列孔，依次作倍比稀释至第十列孔，最后弃去25 μL。然后取4单位病毒液加入每排各孔25 μL至第十一孔（第十二列孔不加），第十一列孔为 4 单位病毒液对照（阴性对照孔）。第十二列孔为PBS液对照（阳性对照孔）。振荡摇匀，置 37℃温箱中反应15 min。再取1% 鸡红细胞悬浮液 25 μL 于各孔中，振荡摇匀后，置 37℃温箱中反应 15～20 min 后观察判定结果。

判定标准：在对照管出现正确结果时，阴性对照孔为凝集现象，阳性对照孔为沉淀现象。则能使 4 单位病毒液凝集红细胞作用完全受到抑制的血清最高稀释倍数作为该血清的血凝抑制价，即抗体效价。

1.9 纳米硅佐剂疫苗和油佐剂疫苗黏度对比实验

在同样的条件下，分别比较在1 ml的滴管内滴完1 ml纳米硅佐剂疫苗样1，1 ml纳米硅佐剂疫苗样2，以及1 ml油苗所需要的时间。分别测三次取平均值记录。

2 结果与讨论

2.1 硅溶胶的电子显微镜照片

图1 硅溶胶的电子显微镜照片

图1硅溶胶的投射电子显微镜照片（本实验室电子显微镜拍摄）。从该图可以看出，硅溶胶颗粒为类球形，尺寸在15～20 nm之间，单分散性好，且无团聚现象。

2.2 纳米硅佐剂疫苗和油苗的黏度比

表1 纳米硅佐剂疫苗样1、纳米硅佐剂疫苗样2和油苗的黏度比

黏度值即1ml溶液滴完所需要的时间，时间越短，说明黏度越低，时间越长，黏度越高。由表1可以看出油苗的黏度要比纳米硅佐剂的黏度高，样2又比样1的黏度高，而黏度过高会影响到疫苗的注射和吸收，因此在黏度上纳米硅佐剂更有优势。而且免疫油苗的试验动物每头份成本要7分钱，而纳米硅佐剂的成本只需0.2分钱。说明纳米硅佐剂的成本更低。

表3 纳米硅佐剂疫苗和冻干苗、油苗的 HI效价对比

2.3 纳米硅佐剂疫苗和冻干苗、油苗的HI效价对比

表3为纳米硅佐剂疫苗和冻干苗、油苗的HI效价对比。在7日龄初次测得的实验结果表明基础免疫的效价为6log2，纳米硅佐剂疫苗样1的效价也为6log2，而纳米硅佐剂疫苗样2在此时就达到了效价为8 log2。说明佐剂疫苗比例不同会产生不同的效价，因此可以调整纳米硅佐剂疫苗的浓度比例，使动物机体在短时间内迅速产生较高的抗体效价，从而具有更好的免疫保护力。在23日龄时，基础免疫组的效价为5 log2，纳米硅佐剂疫苗样1的效价为6.5 log2，纳米硅佐剂疫苗样2的效价为7 log2。说明在此时纳米硅佐剂疫苗比冻干苗产生的抗体水平高。在43日龄时，基础免疫组的效价为5log2，而纳米硅佐剂疫苗的效价都为6 log2，比基础免疫组高出1个单位的效价，充分说明在同样的情况下纳米硅佐剂疫苗能产生更高抗体的效价，这也说明了纳米硅佐剂具有缓释作用，能使抗原逐渐的释放，使动物机体在较长的时间内保持有效的抗体效价。在进行联合免疫后，这主要体现在23日龄后，动物机体产生的抗体效价更高，说明纳米硅佐剂疫苗与冻干苗起到了很好的协同作用。

虽然与油苗相比没有油苗的效价高，但从表1可以知道纳米硅佐剂黏度更低，成本也更低，所以还是具有一定的优势。

3 结论

由上述实验结果可知，纳米硅佐剂疫苗的主要优点为：

（1）吸收快，能使动物机体在短时间内产生有效的抗体效价。

（2）具有非常好的缓释效果，能使动物机体在长时间内保持有效的抗体效价。

因此，纳米硅佐剂疫苗可以作为一种新型疫苗来开发利用。

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