不同稀释剂对獭兔精液保存和授精效果的影响研究

朱文渊李海涛

（1.济宁市畜牧兽医局，山东济宁 272037；2.曲阜市畜牧兽医局，山东曲阜 273100）

不同稀释剂对獭兔精液保存和授精效果的影响研究

朱文渊1李海涛2

（1.济宁市畜牧兽医局，山东济宁 272037；2.曲阜市畜牧兽医局，山东曲阜 273100）

采用单因素随机分组设计研究了4种稀释剂配比对獭兔精子存活时间、精子活力变化及授精效果的影响。结果表明∶生理盐水组（NS组）精子存活时间最长为33.3±1.0h，极显著高于果糖-柠檬酸钠组（Fru-SC组）（23.3±0.6h）、葡萄糖-柠檬酸钠组（G-SC组）（22.3±0.6h）和蔗糖-柠檬酸钠组（Suc-SC组）（21.2±0.8h），Fos-SC组和G-SC组无显著差异，Fos-SC组极显著高于Suc-SC组；精子活力随保存时间增加均呈下降趋势，且在12h以内4组均能满足授精要求。授精试验表明∶保存4h以内，4种稀释剂对獭兔受孕率（70～74%）和产仔率（6.17±1.40～6.44±1.42）均无显著影响。

獭兔；精液；稀释剂；存活时间；精子活力；受孕率；产仔数

獭兔为皮肉兼用品种，具有较高的经济价值。自2013年以来，獭兔价格下行，市场低迷，但优质兔皮仍供不应求。我国是獭兔养殖大国，但养殖水平不高，种质资源退化严重。在欧洲，养兔普遍采用育种公司提供优质鲜精，养殖户人工授精的方式繁殖［1］。人工授精技术的应用可使优质种公兔的利用率提高10倍以上，能加速优质兔群的选育，降低生产成本，并避免各类疾病的垂直传播。当前，我国獭兔的饲养方式主要为庭院养殖，规模小、养殖水平低，繁殖多为本交，仅在部分规模化养殖场逐步采用人工授精。

1 材料与方法

1.1 试验仪器和试剂

显微镜（凤凰XSP-35-1600X）、生物培养箱（上海新苗SPX150）、手提式高压灭菌器（新丰XFS-280）、百分之一电子天平（梅特勒）、兔用采精器、输精枪等。

无水柠檬酸钠、柠檬酸、蔗糖、果糖、葡萄糖均为分析纯，促排卵3号（LHRH-A，宁波三生药业），孕马血清（PMSG，宁波三生药业），生理盐水，青霉素，链霉素等。

1.2 试验动物

选取约12月龄健康美系獭兔种公兔20只，经产2～3胎健康母兔200只做为试验动物，均由曲阜市佳利獭兔养殖合作社种兔场提供。

1.3 稀释液配制

试剂配制所用玻璃器皿、去离子水均在121℃高压灭菌20min，试剂称量使用百分之一天平，准确至0.01g。按表1配制稀释液，每100ml稀释液中含青、链霉素各10IU，2～4号稀释液滴加少量柠檬酸调节pH值到6.5。1到4号稀释液渗透浓度分别为：308mmol/L、400mmol/L、400mmol/L、305mmol/L。配制好后35℃保存备用。

1.4 试验设计

使用假阴道式采精器采集精液，正常精液应为乳白色，无异物，镜检呈云雾状翻腾，活力在0.7以上。将合格的精液混匀，过4层纱布，镜检活力应在0.7以上。

精子活力随时间变化规律和存活时间测定：混精用各组稀释液按1：5的比例稀释混匀，每组各取3份，每份2mL置于灭菌的青霉素小瓶中，于4℃冰箱内保存，于稀释后4h、12h、24h、48h分别检查一次精力活力，并记录存活时间。

表1 不同稀释液配制表

授精试验：采用单因素随机分组设计，每组母兔50只。母兔注射25单位PMSG同期发情，注射后2～5h达到发情高峰。用35℃平衡的各组稀释液按1：5的比例稀释混精，每只母兔输精0.5ml，同时注射0.5单位LHRH-A超排，整个过程在精液稀释后4h内完成。统计受孕率和产仔率。

1.5 数据处理

使用SPSS19.0对试验结果进行单因素方差分析，显著性检验采用LSD法和Duncan法。使用卡方分析对受孕率进行显著性检验。

2 结果分析

2.1 不同稀释剂对精子活力和存活时间的影响

如表2所示，4类稀释液对精子存活时间的影响存在极显著差异。NS组精子存活时间最长，极显著高于其它3组（P＜0.01）。Fru-SC组和G-SC组精子存活时间无显著差异（P＞0.05），Fru-SC组精子存活时间极显著高于Sur-SC组（P＜0.01），G-SC组和Sur-SC组稀释液之间存活时间无显著差异（P＞0.05）。各组稀释液精子活力随时间均呈下降趋势，但在12h以内，精子活力均大于0.6，能满足人工授精的要求。

表2 不同稀释剂对精力活力变化和存活时间的影响 n=3

2.2 不同稀释剂对受孕率和产仔数的影响

不同稀释剂对獭兔人工授精受孕率和平均产仔数的影响如表3所示。各组的受孕率在70～74%之间，和该场年平均受孕率72%左右持平。Fru-SC组平均产仔数最高达到6.44只，NS组6.17只的平均产仔数最低，但均高于该厂年平均窝产仔数6只的水平。各组稀释液之间受孕率和平均产仔数均无显著性差异（P＞0.05）。

表3 不同稀释剂对受孕率和产仔数的影响

3 讨论

（1）张兆旺（2001）研究表明，使用8种不同的稀释剂配方，平均精子生存指数均在等渗浓度附近（300mmol/L）最高［2］。在偏高渗的环境中精子可以保持流线型的正常形态，且对精子存活时间、生存指数均无显著影响［2］。精子在偏酸性环境下，活动力降低，可较长时间保持授精能力［3］。柠檬酸钠可以起到抗精子凝集和缓冲pH值的作用；蔗糖具有保护生物膜，维持精子正常生理形态的功能。果糖和葡萄糖均是精子可利用的营养物质。因此，本试验中所使用的4中稀释剂为等渗或微高渗，并调节pH值到6.5，在此基础上研究不同成分对精液保存时间、活力等各项指标的影响。本试验结果表明，保存12h以内精子活力下降缓慢，各组稀释液均能满足人工授精的要求。存活时间NS组最长极显著高于其它3组，此结果和张兆旺（2001）［2］在鸡上的研究结果一致，究其原因可能是钠离子对精子的兴奋作用有关。两种单糖的添加对精子存活时间无显著影响，这表明在适宜缓冲条件下，因精子利用单糖而导致pH值下降的损伤可以消除。蔗糖在稀释剂中主要起维持精子正常形态的作用，对提高存活时间并未表现出作用，这也可能是由于各组间缓冲浓度的不同造成的。

（2）授精试验结果显示，各组间受孕率无显著性差异，且均高于70%，这和孙亚红（2011）在长毛兔上的实验结果基本一致［4］，也和该场年平均受孕率72%左右持平。平均产仔数NS组最低，这可能是由于在NS保存过程中会造成精子畸形率过高导致，因此，NS组较高的精子存活时间可能并无应用价值。Sur-SC组在存活时间上略低，在保存12h以内精子活力与其它各组无显著差异，且受孕率和平均产仔数和其它各组均无显著性差异，鉴于蔗糖对细胞膜的保护作用，由此推断在精子保存时间延长的时候可能会有较好的授精效果。

4 结论

在本试验条件下可以得出以下结论：4℃保存条件下，使用4种稀释液精子存活时间由长到短依次为生理盐水组、果糖-柠檬酸钠组、葡萄糖-柠檬酸钠组和蔗糖-柠檬酸钠组；随保存时间的延长，各组稀释液精子活力呈下降趋势，在12h以内均能满足人工授精的要求。使用各组稀释液，精子保存时间在4h以内进行授精试验并不影响獭兔的受孕率和产仔率。生理盐水获取简便，在精子短期保存的条件下（4h以内）建议选用生理盐水做为精子稀释剂。

［1］ 秦应和，李福昌，余志菊，等.欧洲三国兔业考察报告［J］.草食与畜牧，2010，（11）：56-60.

［2］ 张兆旺.稀释液溶质和渗透压对精子体外存活及形态的影响［J］.中国家禽，2001，23（8）：50-52.

［3］ 穆秀名，吴淑琴，王净，等.不同稀释液对塞北兔精液保存效果的影响［J］.黑龙江动物繁殖，2011，19（2）：11-13.

［4］ 孙亚红，聂文贵，裴学，等.不同季、不同稀释液对长毛兔人工授精对比试验［J］.黑龙江畜牧兽医，2011，（1）：62-63.