温度对猪圆环病毒培养滴度的影响

邱贞娜梁 武朱秀同郁宏伟柳 珊李晓艳刘 涛

（1.瑞普（保定）生物药业有限公司，河北保定 071000；2.河北省兽医生物技术工程技术研究中心，河北保定 071000）

温度对猪圆环病毒培养滴度的影响

邱贞娜1，2梁 武1，2朱秀同1，2郁宏伟1，2柳 珊1，2李晓艳1，2刘 涛1，2

（1.瑞普（保定）生物药业有限公司，河北保定 071000；2.河北省兽医生物技术工程技术研究中心，河北保定 071000）

为了猪圆环病毒生产批次间滴度的稳定性，提高病毒产量，本实验对猪圆环病毒的培养温度参数进行了研究。结果显示，病毒培养温度36℃时，收获毒液病毒滴度明显下降，培养温度为37℃和38℃时，病毒滴度基本持平，均能稳定在较高水平。

猪圆环病毒；培养温度；病毒滴度

0 引言

猪圆环病毒是（Porcine circovirus type 2，PCV2）一种圆形小颗粒病毒，粒子直径为 17 nm，呈 20 面体对称，无囊膜，CsCl 浮力密度为 1.37g/cm3，是引起仔猪断奶后多系统衰竭综合征的病原。PCV2 感染可导致动物机体免疫系统功能严重受损，形成免疫抑制，增强对其它多种病原体的易感性，引起在正常情况下具有较低致病性的病原体感染发病，使猪群发生难以控制的复发性疾病和多重感染［1］。该病呈世界流行，我国的大型猪场普遍存在该病，给养猪业造成了相当大的经济损失，疫苗免疫是控制PCV2 感染引起相关疾病的重要手段。

PK15细胞是PCV2敏感细胞系，被广泛用于疫苗生产。本实验就PK15细胞培养PCV2的温度参数进行了研究，以期找到最佳病毒培养温度，保证疫苗生产中批次间的稳定性，提高病毒产量。

1 材料和方法

1.1 主要试剂和生物材料

猪肾传代细胞系（PK-15细胞）和猪圆环病毒2型（ZJ-C株）由公司种毒室保存和提供；新生牛血清、MEM干粉培养基购自gibco公司；PCV2-cap单克隆抗体购自浙江同点生物技术有限公司；羊抗鼠二抗购自KPL公司。

1.2 猪圆环病毒培养

长成良好单层的PK-15细胞，采用EDTA-胰酶消化，经吹打分散均匀，细胞计数后，接种培养瓶，同时加入猪圆环病毒；分成3个试验组，分别于36℃、37℃和38℃培养，48h时弃去培养液，更换3%血清的维持液，再培养40h，收获，将培养瓶反复冻融3次，取样后冷冻保存。

1.3 病毒滴度测定

将病毒液用不含血清的MEM液10倍系列稀释，取10-5、10-6、10-7三个滴度接种96孔板，0.1ml/孔，每滴度6孔，同时接入0.1ml分散均匀的PK15细胞，37℃培养72h，冷丙酮固定，采用IFA法检测，统计病毒感染孔数，按照Reed-Muench法计算半数细胞感染量（TCID50/ml）。

2 结果

试验结果见表1，可见猪圆环病毒培养温度为37℃和38℃时，两组病毒滴度基本持平，均能达到107.5TCID50/ml，维持在较高水平；培养温度为36℃时，病毒滴度明显下降，降幅接近0.5个滴度。

表1 不同培养温度收获毒液病毒滴度

3 讨论

猪圆环病毒复制过程中，依赖宿主细胞的聚合酶，这种酶类主要是在细胞繁殖的S周期中合成，培养温度能影响酶类的活力，从而影响病毒的复制，在猪圆环病毒培养过程中，要关注培养环境的温度［2-3］。

本次实验的结果显示，温度低至36℃时，病毒的繁殖滴度明显下降，猪圆环病毒疫苗生产中普遍使用细胞转瓶生产工艺，细胞转瓶置于温室中，因为空气循环不均，常常造成温室内温度的不均衡，一些位置温度偏低，这会造成大生产中猪圆环病毒滴度的下降，也是影响批间稳定性的一大因素。而本次实验也证明，培养温度达到38℃左右时，病毒滴度并没有下降，所以在大生产中，可适当提高整体环境温度，减少低温死角，提高病毒滴度，减少批次间的差异。

［1］ 宣长和，马春全，陈志宝［M］.北京：中国农业出版社，2010：172-180.

［2］ 刘长明，张超范，危艳武，等.猪圆环病毒2型细胞培养适应毒株的培育和鉴定［J］.中国兽医预防学报，2006，（3）：248-252.

［3］ 王宪文，姚四新，刘兴友，等.猪圆环病毒2型复制及其影响因素［J］.中国畜牧兽医，2011，（3）：220-223.

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