超声引导下急性缺血性左室舒张功能障碍并二尖瓣反流犬模型的构建

孙 静,范春芝,窦健萍,温朝阳



超声引导下急性缺血性左室舒张功能障碍并二尖瓣反流犬模型的构建

孙 静1,范春芝2,窦健萍3,温朝阳4

目的 探讨超声引导下急性缺血性左室舒张功能障碍并二尖瓣反流犬模型的构建。方法 (1)二尖瓣反流模型的建立：比格犬15条，经左颈动脉穿刺并送入动脉鞘。在超声引导下，将动脉鞘送入左室，鞘前端置于二尖瓣前叶边缘，经动脉鞘将内镜活体取样钳置于二尖瓣尖下，钳断二尖瓣腱索。经胸心脏超声证实存在二尖瓣反流。(2)急性缺血性左室舒张功能障碍模型的建立：在超声引导下，外撤动脉鞘使其前端置于左冠状动脉窦内，间歇多次注射塑料微球于左冠状动脉窦内，微栓塞冠状动脉，左室舒张末压升高≥5 mmHg定义为建模成功，形成急性缺血性舒张功能不全。结果 (1)15条比格犬制作二尖瓣反流模型全部成功；14条犬形成中度二尖瓣反流，1条比格犬造成重度二尖瓣反流。多普勒频谱测量二尖瓣反流，V max为(483.0 ±1.1) m/s，PG max为(162.7± 1.8) mmHg。(2)15条二尖瓣反流比格犬进行急性缺血左室舒张功能障碍模型构建，成功12条，3条未成功。12条成功模型的左室舒张末压升高、最大左室压力下降速率(-dP/dtmax)降低、左室松弛时间常数(Tau)延长。结论 超声引导下，经颈动脉鞘管送入活检钳钳夹二尖瓣腱索制造二尖瓣反流(MR)、间歇多次注射微球入左冠状动脉窦构建急性缺血性舒张功能障碍比格犬模型，具有操作简便、方法可靠、成功率高等优点。

超声引导；二尖瓣反流；急性心肌缺血；左室舒张功能障碍；比格犬动物模型

既往报道的急性缺血性左室舒张功能受损模型主要有冠脉结扎法，这种方法创伤大，动物死亡率较高。传统的二尖瓣反流动物模型分为开胸法和导管法[1,2]。开胸法为开胸后经肺静脉或左房顶部送入尖刀切断二尖瓣腱索造成二尖瓣反流。导管法是经X线引导，经股动脉鞘管将带切割头的器械送至左心室造成二尖瓣腱索的损伤，导致二尖瓣反流，由于X线不能显示二尖瓣、瓣下结构及它们随心动周期而运动的状态，可能需反复操作才能成功。开胸法和导管法构建二尖瓣反流操作烦琐，具有一定盲目性，使应用受到一定限制。

超声可实时观察、引导微创操作，精准、高效、无辐射，在文献[1-6]报道的二尖瓣反流及左室舒张功能障碍模型构建方法的基础上，探索在超声引导下构建二尖瓣反流并急性缺血导致的左室舒张功能障碍的比格犬模型。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康成年比格犬15只，雌性6只，雄性9只，体重12～16 kg，平均(13.4±1.2)kg；犬龄2.2～3.5岁，平均犬龄(2.9±0.5)岁。解放军总医院实验动物中心采购。动物购入后适应一周后再行手术造模。

1.2 实验仪器与试剂

1.2.1 主要试剂及配制 注射用血凝酶(立芷雪，深圳健安医药有限公司，1000 U/2 ml)。凝血酶冻干粉(长春国奥药业有限公司, 1000 U/2 ml)用灭菌氯化钠注射液溶解成每1 ml中含100 U的溶液。肝素钠(上海第一生化药业有限公司，1000 U/2 ml)用0.9%氯化钠注射液配置成每500 ml含1000 U的肝素水，冲洗鞘管及各种导管。三聚氰胺甲醛树脂微球(武汉华科微科科技有限责任公司，1000 U/2 ml)。200 mg微球溶于100 ml右旋糖酐40氯化钠注射液中，置入声波震荡仪中摇匀，备用。

1.2.2 主要仪器 超声仪：DC-7型彩色多普勒超声仪，相控阵心脏探头，频率2.5 MHz(迈瑞医疗国际股份有限公司，中国深圳)。多导生理记录仪：ML866 PowerLab 4(Adinstruments公司，澳大利亚，Chart7分析软件)。桥式放大器：ML221(Adinstruments公司，澳大利亚)。Millar测压导管：SPR-320(Millar 公司，美国)。呼吸机：SERIES7200(中农同创生物科技有限公司，北京)。除颤仪：CJ-2(Philips公司，荷兰)。动脉鞘：5F、6F、7F(泰尔茂医疗产品有限公司，日本)。指引导丝：GA35153、GA35183(泰尔茂医疗产品有限公司，日本)。内镜活体取样钳：MTN-BF-18/12-A(南京微创医学科技有限公司，中国)。

1.3 方法

1.3.1 二尖瓣反流犬模型建立 犬术前禁食12 h，禁水4 h，颈部、前胸、腹股沟处备皮。首先用地西泮(50 mg/kg，肌内注射)镇静，司可林(50 mg/kg)、3%戊巴比妥那(l ml/kg)静脉麻醉，3%戊巴比妥那 30 mg/(kg·h)维持，直至实验结束。采用仰卧位，气管插管，呼吸机辅助呼吸。心电图连接于超声仪及生理记录仪，实时显示并可同步记录Ⅱ导联心电图。术前15 min肌注立芷雪0.5 U。

分离左侧颈总动脉，局部滴利多卡因注射液0.5 ml防止血管痉挛。开胸，暴露心脏，切开心包。并用适量凝血酶冻干粉溶液喷洒创面防止伤口处渗血过多。将左颈动脉远端结扎，16 G套管针左侧颈动脉穿刺，穿入指引导丝，超声引导下观察导丝进入左心室，沿导丝送入5 F长动脉鞘至左心室，撤出指引导丝。将心脏超声探头放于心脏表面，选择左心室长轴、心尖四腔心等切面，实时指导动脉鞘前端放置于二尖瓣前叶近瓣尖处，送入内镜活体取样钳，超声观察活检钳头端置于二尖瓣前叶边缘下方处，张开活检钳待瓣叶开放时钳夹腱索，以造成腱索断裂(图1)，超声观察有中量或大量反流出现，定义为造膜成功。撤出活检钳，将左侧颈动脉导管鞘外撤入升主动脉。超声测量二尖瓣反流速度及压差。用心耳钳将心耳提起，插入压力导管，多导生理仪显示并记录左心房压力曲线。缝制心包吊床，将心包吊起、固定。

自心尖处将Millar导管插入左心室，多导生理仪显示并记录左室压力曲线及dP/dt曲线。

二尖瓣反流程度判定标准，以多普勒彩色反流面积估计：轻度，<20%左房面积；中度，20%～40%左房面积；重度，>40%左房面积。

多导生理记录仪显示并记录心电图、左室舒张末压、最大左室压力下降速率(-dP/dtmax)及左室松弛时间常数(Tau)，作为构建急性缺血性左室舒张功能受损模型的基础数值。

图1 二尖瓣反流犬模型建立中钳夹后二尖瓣腱索断裂箭头所指为断裂腱索的断端

1.3.2 急性缺血性左室舒张功能障碍模型建立 在左室长轴切面及大动脉短轴切面，超声引导下将左侧颈动脉内动脉鞘前端置于左冠状动脉窦内。然后将三聚氰胺微球溶液间歇多次注入左冠状动脉窦(图2)，首次2 ml，以后每次0.5～2 ml，间隔5～10 min，微栓塞2～9次/犬。观察LVEDP升高≥5 mmHg，定义为诱发急性缺血性左室舒张功能障碍成功。

超声引导下，将动脉鞘后撤至其前端位于升主动脉，动脉鞘连接于测压导管，多导生理仪记录主动脉压力曲线。

图2 急性缺血性左室舒张功能障碍犬模型超声经动脉鞘向左冠窦注入微球溶液，箭头所示的左冠窦呈烟雾状回声

2 结 果

比格犬15只全部成功制作二尖瓣反流模型。13只钳夹致腱索断裂造成二尖瓣脱垂，1只钳夹造成二尖瓣前叶裂孔，上述14只犬形成中度二尖瓣反流(1只犬存在自然二尖瓣轻度反流，钳夹腱索断裂后形成中度反流)，另1只钳夹形成瓣叶裂孔并腱索断裂，造成重度二尖瓣反流。连续多普勒频谱测定，Vmax为(483.0±1.1) cm/s；PGmax为(162.7±1.8) mmHg。

12只构建急性缺血左室舒张功能障碍模型成功，有2只犬栓塞4次，5只栓塞5～6次，4只栓塞8次，1只栓塞9次。平均耗时1.5 h。3只未成功，其中有1只死于室颤，1只死于心电机械分离，1只死于严重心梗、血流动力学不稳定。成功模型的LVEDP升高、-dP/dtmax下降、Tau延长，均提示左室舒张功能明显受损(表1)。

表1 比格犬注射微球前及模型成功后血流动力学参数比较 (n=12；±s)

注：与基础状态比较，①P<0.05

3 讨 论

本研究采用超声引导下，经颈动脉鞘送活检钳至左心室，活检钳对二尖瓣前叶腱索进行钳夹，切断腱索造成二尖瓣反流，具有精准、高效的优势。实验结果显示15只模型全部制作成功，1只超声探查发现术前存在轻度自然反流，钳夹腱索断形成中度二尖瓣反流。手术成功率高，无一只因制造二尖瓣反流模型而死亡。主要体会：首先，在入路上我们选择左颈动脉通路，导管所经途径较股动脉短，更易到达左心室，便于术者操作；其次，超声能够实时、清晰地显示瓣膜及瓣下结构、二尖瓣开闭状态，能够准确指导调整活检钳放置位置，达到“靶向损伤”；第三，超声能实时观察有无反流及反流程度，活检钳操作简便可多次重复，以达到不同反流程度需求。

既往报道的急性缺血性左室舒张功能受损模型主要有冠脉结扎法和经导管注射微球法[7，8]。开胸后结扎冠状动脉的分支导致心肌梗死构建左室舒张功能受损模型[5，9，10]有其缺陷性。结扎大动脉，容易因急性心肌缺血而造成室速、室颤、房室传导阻滞、电机械分离等恶性心律失常，导致动物猝死；或因大面积心梗而造成急性左心衰竭、室壁瘤、心脏破裂等严重并发症，导致动物无法耐受下一步实验。而常规微球栓塞冠状动脉制作方法，则需借助介入技术[11]，而开展这一技术需要大型X光造影机，需要操作人员具有一定的介入操作能力，且对人体具有一定量的辐射损害。相对动物而言，非大型动物使用常规型号的造影导管难以推送入主动脉窦部，更难以实行对某支冠脉的超选择微栓塞。对于介入技术的过分依赖，造成该方法难以广泛应用。

本研究通过超声引导下，经颈动脉穿刺插置入动脉鞘至左冠状动脉窦口，注射微球反复微栓塞冠状动脉。冠脉微血管为直径小于200 μm的血管，毛细血管平均直径7 μm，本研究使用微球平均直径为51.7 μm，说明微球可充分弥漫于小的冠状动脉末端，造成微栓塞，建立动物模型。

文献[12,13]报道，LVEDP升高≥5 mmHg即为舒张功能受损，导管法测量Tau指数正常应<40 ms。以上实验动物经过反复冠脉微栓塞后，出现不同程度的LVEDP升高，-dP/dtmax下降、Tau延长，均提示左室舒张功能障碍模型成功[14-17]。稳定的模型建立大约需要耗时1.5 h。由于室颤、血流动力学不稳造成死亡的3只犬，均发生于实验初期，主要由于初对微球注射间隔时间的把握经验不足，注射间隔较短所致。

总之，超声引导下，经颈动脉鞘管送入活检钳钳夹二尖瓣腱索制造二尖瓣反流(MR)、间歇多次注射微球入左冠状动脉窦构建急性缺血性舒张功能障碍比格犬模型，具有操作简便、方法可靠、成功率高等优点。

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(2016-05-20收稿 2016-07-10修回)

(责任编辑 武建虎)

Establishing the model of acute ischaemic left heart failure with mitral regurgitation in beagles

SUN Jing1, FAN Chunzhi2, DOU Jianping3, and WEN Chaoyang4.

1.Department of Cardiology, Shaanxi Provincial Corps Hospital of Chinese People’s Armed Police Force, xi’an 710054, China; 2.Department of Ultrasonic Medicine, Beijing Chaoyang Hospital, Capital Medical University, Beijing 100043, China;3.Department of Ultrasonic Medicine, PLA General Hospital, Beijing 100853，China；4. Department of Ultrasonic Medicine, The First Affiliated Hospital of PLA General Hospital, Beijing 100048，China

Objective To establish the model of acute ischaemic left heart failure with mitral regurgitation in beagles. Methods (1)The construction of mitral regurgitation (MR)animal model: a catheter was introduced into left ventricle through the carotid artery in 15 experiment beagles, then a biopsy clamp was put into the mitral valve nearby through the catheterization and chordae tendineae was pinched under the guidance of echo in order to construct mitral regurgitation．(2) The construction of acute ischaemic left ventricular (LV) diastolic heart failure: 15 beagles with MR were further processed with coronary microembolization by microspheres repeatedly. Results (1) All mitral regurgitation models were successfully produced. The chordae tendineaes were broken in thirteen dogs, causing moderate MR. One dog with natural mild MR was with broken chordae tendineae. Continuous wave Doppler showed that the MR peak velocity was (483±1.12) cm/s, the maximun pressure gradient was (162.7±1.8) mmHg. (2)12 models of acute ischaemic left diastolic heart failure with mitral regurgitation were established. Left ventricular end-diastolic pressure emitting equal or greater than 5 mmHg was defined as model successful. The left ventricular end-diastolic pressure (LVEDP), -dP/dtmax, Tau-c in successful model were increased significantly (P<0.05). Conclusions This method is safe, feasible and easily successful in constructing the MR animal model under the guidance of transthoracic echocardiography．Coronary microembolization with microspheres is a sueeessfull way for establishing the acute ischaemic left diastolic heart failure.

guiding of transthoracic echocardiography; MR; acute myocardial ischaemic; left ventricular (LV) diastolic failure; beagles animal model

孙 静，硕士研究生，主治医师。

710054 西安，武警陕西总队医院心内科；2.100043 北京，首都医科大学附属北京朝阳医院超声医学科；3.100853 北京，解放军总医院介入超声科；4.100048 北京，解放军总医院第一附属医院超声科

温朝阳，E-mail：wency301@vip.sina.com

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