响应面法优化米曲霉发酵液嫩化香菇柄工艺*

魏书信，王安建，朱广成，高帅平，李顺峰，田广瑞

（河南省农科院农副产品加工研究所，河南郑州450002）

响应面法优化米曲霉发酵液嫩化香菇柄工艺*

魏书信，王安建，朱广成，高帅平，李顺峰，田广瑞

（河南省农科院农副产品加工研究所，河南郑州450002）

以香菇副产物香菇柄为原料，利用米曲霉发酵液作为嫩化剂，通过单因素试验和响应面法试验，优选出米曲霉发酵液嫩化香菇柄的最佳工艺为发酵液浓度30.4%、pH自然、处理温度53℃、处理时间4.8 h。此条件下嫩化处理的香菇柄咀嚼性为16.25 mJ。研究结果表明，米曲霉发酵液作用于香菇柄的嫩化效果良好。这为香菇柄的深度开发利用提供了新的思路。

米曲霉；发酵液；香菇柄；嫩化

香菇柄是香菇商品化处理的主要副产物，约占总菇重的30%左右，100 g菇柄含膳食纤维55.53 g［1］，高含量的膳食纤维使得香菇柄粗韧难嚼、适口性差，以致实际利用率不高［2-4］。由于价格低廉，许多香菇柄因干制不及时、贮藏不当而腐烂被废弃。为了充分利用香菇柄资源，需对其进行嫩化处理，以改善口感、拓宽用途，从而实现价值提升。目前嫩化研究的主要对象为肉类原料，而关于香菇柄嫩化的研究极少，嫩化方法主要有超声波法［5］、酶法［6-7］、钙盐法［8］、柠檬酸法［9］等。其中酶法嫩化应用最广泛。米曲霉增殖过程中能产生纤维素酶、蛋白酶等多种酶［10-11］。米曲霉酶系对纤维、蛋白质等物质具有较强的分解作用，用来处理木薯渣、豆渣等高纤维原料可显著改善其粗韧的口感［12-13］，将其应用于香菇柄嫩化具有技术可行性。本实验以米曲霉发酵液为嫩化剂，通过单因素试验和响应面工艺优化试验，研究米曲霉发酵液的嫩化效果并优化嫩化工艺，以期为香菇柄的全面开发利用提供一定的理论参考。

1　材料与方法

1.1主要试验材料

香菇柄：长垣蒲田食用菌专业合作社提供；米曲霉（Aspergillus oryzae）CICC2085，购于中国工业微生物菌种保藏管理中心；麦芽汁培养基和麦芽汁琼脂培养基，购于北京陆桥技术有限责任公司。发酵培养基：香菇柄粉3%、K2HPO40.1%、MgSO4·7H2O 0.05%、KCl 0.05%、FeSO40.001%，pH自然。

1.2主要仪器与设备

TMS-PRO物性测定仪，美国FTC公司；BIOTECH-3BG-7000A自动发酵罐，上海保兴生物设备工程有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器，郑州予华仪器制造有限公司；FY-35L反压高温蒸煮仪，河北方圆仪器设备有限公司；TD4ZWS台式低速离心机，长沙维尔康湘鹰离心机有限公司；HZQ-X300C恒温振荡器，上海一恒科学仪器有限公司。

1.3试验方法

1.3.1菌种培养

斜面培养：将保存菌种米曲霉接入麦芽汁琼脂斜面培养基，29℃恒温培养7 d。

活化培养：将米曲霉斜面菌种接入装有麦芽汁培养基的三角烧瓶中，29℃恒温震荡培养7 d。同法转接3代，使其恢复活力。

产酶发酵培养：按1%接种量将米曲霉转移到装有液体发酵培养基的自动发酵罐中，转速300 r·min-1，29℃下培养7 d，将发酵完的产物搅拌均匀，4 000 r·min-1离心10 min，含酶的上清液作为米曲霉发酵液备用［14］。

1.3.2香菇柄处理方法

选取粗细基本一致的新鲜香菇柄，从根部起切取长度1.5 cm作为待处理香菇柄。取10 g菇根置于装有70 mL发酵液稀释液的三角瓶中，放在恒温加热磁力搅拌器上进行嫩化处理。处理结束后煮熟放凉，将菇柄躺放，用物性测定仪进行全质构检测，取咀嚼性作为嫩化的评判标准。以未嫩化处理直接煮熟放凉的香菇柄作为对照。每组试验均做3次重复，取平均值。

1.3.3单因素试验

（1）发酵液浓度对香菇柄咀嚼性的影响

按照1.3.2方法，将香菇柄置于发酵液体积百分浓度0、15%、20%、25%、30%、35%的发酵液稀释液中，发酵液稀释液pH值自然，50℃处理3 h。

（2）pH值对香菇柄咀嚼性的影响

按照1.3.2方法，将香菇柄置于1.3.3（1）筛选的最佳发酵液浓度的发酵液稀释液中，发酵液稀释液pH值分别调为4.5、5.5、6.5、7.5、8.5、 9.5，50℃处理3 h。

（3）处理温度对香菇柄咀嚼性的影响

按照1.3.2方法，将香菇柄置于1.3.3（1）筛选的最佳发酵液浓度的发酵液稀释液中，发酵液稀释液pH值调为1.33（2）筛选的最佳pH值，分别在44℃、47℃、50℃、53℃、56℃、59℃下处理3 h。

（4）处理时间对香菇柄咀嚼性的影响

按照1.3.2方法，将香菇柄置于1.3.3（1）筛选的最佳发酵液浓度的发酵液稀释液中，发酵液稀释液pH值调为1.3.3（2）筛选的最佳pH值，在1.3.3（3）筛选的最佳温度下处理3 h。

1.3.4响应面优化试验设计

在单因素试验结果的基础上，在自然pH值的条件下，以发酵液浓度、处理温度、处理时间为响应因子，以香菇柄的咀嚼性为响应值，根据Box-Behnken设计三因素三水平优化试验，试验因素及水平编码见表1。

表1　响应面法试验因素及水平编码Tab.1Test factors and levels of response surface experiment

1.3.5咀嚼性的测定

采用TMS-PRO物性测定仪，选择TPA-2500N探头，设定量程为2 500 N，形变量50%，检测速度60 mm·min-1，最小起始力5 N，停留间隔5 s，将菇柄躺放沿垂直于香菇柄纤维方向测其物性指标。每组样品选测8个菇柄，咀嚼性取平均值。

1.4数据处理

数据采用Microsoft Excel 2010和Design-Expert8.0.6进行分析，利用Design-Expert8.0.6和Origin 2015制图。

2　结果与分析

2.1单因素试验

2.1.1发酵液浓度对香菇柄咀嚼性的影响

发酵液浓度对香菇柄咀嚼性影响试验的结果见图1。

由图1可见，对照组（0）咀嚼性为最高，说明米曲霉发酵液具有一定的嫩化效果；随着发酵液浓度的逐渐增大，咀嚼性呈先降低而后又增高的趋势，发酵液浓度为30%时咀嚼性最低。原因是发酵液中含有纤维素酶、半纤维素酶、蛋白酶等多种酶，酶的催化反应引起菇柄中蛋白、纤维等物质的分解降解，前期随着发酵液浓度不断增加，各种酶促反应加快，从而引起菇柄的咀嚼性降低，当发酵液浓度超过30%时，酶之间出现竞争性抑制，反而不利于酶促反应的进行，引起咀嚼性上升。30%为香菇柄嫩化的最佳发酵液浓度。

图1　发酵液浓度对香菇柄咀嚼性的影响Fig.1Effect of the fermentation concentration on the chewiness of mushroom stem

2.1.2pH值对香菇柄咀嚼性的影响

固定发酵液浓度为30%，pH值对香菇柄咀嚼性影响试验的结果见图2。

图2　pH值对香菇柄咀嚼性的影响Fig.2Effect of the pH on the chewiness of mushroom stem

由图2可见，pH值对咀嚼性的影响呈近V形走势，pH为6.5时咀嚼性最低，pH逐步变酸或逐渐偏碱时咀嚼性均呈明显的上升趋势。分析原因是所有酶均具有最适宜的pH值，米曲霉发酵液中起嫩化作用的酶类可能均为偏中性酶。6.5为最佳pH值。由于试验前采取先检测原始pH值再决定加酸或加碱调节pH值，得知发酵液浓度为15%～35%时的pH值为6.1～6.8，区间包含最佳pH值6.5，本着添加物越少越好的原则，选择自然pH值为最佳值。

2.1.3处理温度对香菇柄咀嚼性的影响

固定发酵液浓度为30%，pH值自然，处理温度对香菇柄咀嚼性影响试验的结果见图3。

图3　处理温度对香菇柄咀嚼性的影响Fig.3Effect of the processing temperature on the chewiness of mushroom stem

由图3可见，在试验温度范围内，随着温度的升高，香菇柄的咀嚼性呈现先降低后又升高的趋势，这是由于前期随着温度的升高，复合酶的催化反应加快，但当温度升至较高时，温度偏离了酶的最佳作用温度而导致嫩化效果降低。53℃为最佳处理温度。

2.1.4处理时间对香菇柄咀嚼性的影响

固定发酵液浓度为30%，pH值自然，在53℃条件下，处理时间对香菇柄咀嚼性影响试验的结果见图4。

图4　处理时间对香菇柄咀嚼性的影响Fig.4Effect of the processing time on the chewiness of mushroom stem

由图4可见，前期随着处理时间的延长，咀嚼性呈快速降低的趋势，超过5 h后又开始逐步上升。这是由于前期随着发酵液中的酶不断催化菇柄内纤维、蛋白等成分的分解降解而引起咀嚼性的快速降低，5 h酶解达到最高峰，时间再延长时酶解的分解作用增加有限而因长久热作用累积导致菇柄组织收缩老化的负面作用开始显现，从而导致咀嚼性升高。最佳酶解时间为5 h。

2.2响应面优化试验结果与分析

响应面试验设计和结果见表2，试验结果方差分析见表3。

利用Design Expert分析软件对试验数据进行回归分析，得到米曲霉发酵液处理香菇柄的二次回归模型：

表2　响应面试验设计与结果Tab.2Design and results of response surface experiment

模型P=0.0018＜0.01，表明该模型极显著；失拟项P=0.2481＞0.05，失拟项不显著，说明本模型受A、B、C以外的其他因素的影响较小。R2=0.9387＞0.8，说明应用该方程对本试验进行预测和分析的拟合性较好，可信度较高。

方差分析结果表明，A2、B2和C2对香菇柄嫩化的影响都极显著。比较P值大小可知，在选定的试验因素水平范围内，三因素对香菇柄咀嚼性影响大小为：处理时间＞处理温度＞发酵液浓度。

根据响应面试验结果作出咀嚼性响应面图，结果见图5。

表3　试验结果方差分析Tab.3Variance analysis of test results

由图5a、图5b可知，当处理温度和处理时间不变时，随着发酵液浓度的增加，咀嚼性呈先降低后增加的趋势，浓度范围在29%～31%时咀嚼性最低；由图5a、图5c可以看出，当发酵液浓度和处理时间固定时，随着处理温度的增加，咀嚼性呈先降低后增加的趋势，温度范围在52℃～53℃时咀嚼性最低；由图5b、图5c表明，当处理时间和发酵液浓度不变时，随着处理时间的增加，咀嚼性呈先缓慢降低后快速提高的趋势，处理时间为4.5 h～5 h时咀嚼性最低。

根据响应面法建立的数学模型分析，预测出米曲霉发酵液嫩化香菇柄的最佳工艺条件为发酵液浓度30.36%，处理温度52.62℃，处理时间4.8 h。在此条件下咀嚼性的预测值为16.114。为验证此最佳工艺的可靠性，结合试验仪器的精确度，将最佳工艺参数修改为发酵液浓度30.4%，处理温度53℃，处理时间4.8 h，在此条件下做平行试验3次，香菇柄的平均咀嚼性为16.25 mJ，与预测值差别很小，说明模型方程与实际试验具有良好的拟合性。

图5　因素交互作用对咀嚼性的影响Fig.5 Effect of factor interaction on the chewiness of mushroom stem

3　结论

采用米曲霉发酵液作为嫩化剂，利用发酵液中的各种酶作用于香菇柄进行嫩化，单因素和响应面法研究结果表明，米曲霉发酵液对香菇柄具有良好的嫩化效果。研究优化的香菇柄嫩化最佳工艺为发酵液浓度30.4%、pH自然、处理温度53℃、处理时间4.8 h。此条件下嫩化处理的香菇柄咀嚼性为16.25 mJ，感官鉴定咬感显著改善，非常容易咀嚼。

本研究先采用液体发酵制备米曲霉发酵液，再以米曲霉发酵液为嫩化剂稀释后处理香菇柄，嫩化处理用时只需4 h～5 h。嫩化后的香菇柄色泽，风味基本无变化，与香菇柄直接发酵处理周期较长、原料呈酱香风味、用途较窄相比，具有显著的特点，嫩化后的香菇柄适宜加工片状、粒状、丝状等各种食品，极大地拓宽了香菇柄的用途，为香菇柄的深度开发利用提供了新的途径。

［1］刘存芳，田光辉，赖普辉，等.香菇柄中营养成分的开发与利用综述［J］.科技信息，2008（1）：14-15.

［2］吴丽樱，苏东洋，张拥军，等.非化学改性香菇柄膳食纤维的理化特性研究［J］.食用菌，2014（4）：67-69.

［3］黄茂坤，林娈，潘超然.香菇柄仿真肉味素食品的研制［J］.江苏农业科学，2011，39（6）：439-442.

［4］陈龙，郭晓辉，李富华，等.食用菌膳食纤维功能特性及其应用研究进展［J］.食品科学，2012，33（11）：303-307.

［5］Hung CC，Ren XW.Textural and biochemical properties of cobia（Rachycentron canadum）sashimi tenderized with the ultrasonic water bath［J］.Food Chemistry，2012，132（3）：1340-1345.

［6］Ashie INA，Sorensen TI，Nielson PM.Effects of papain and a microbial enzyme on meat proteins and beef tenderness［J］. Journal of Food Science，2002，67（6）：2138-2142.

［7］Sullivan GA，Calkins CR.Application of exogenous enzymes to beef muscle of high and low-connective tissue［J］.Meat Science，2010，85（4）：730-734.

［8］Polidori P，Marinucci MT，Fantuz F，et al.Tenderization of wether lambs meat through pre-rigor infusion of calcium ions［J］.Meat Science，2000，66（2）：197-200.

［9］Shuming K，Yan H，Eric A，et al.Impact of citric acid on the tenderness，microstructure and oxidative stability of beef muscle［J］.Meat Science，2009，82（1）：113-118.

［10］刘丽萍，刘丽华.米曲霉的研究进展与应用［J］.中国调味品，2008（4）：28-32.

［11］李敏，厚华艳.米曲霉液体培养条件优化［J］.中国调味品，2011（4）：8-50.

［12］汤小朋，赵华，汤加勇，等.黑曲霉固态发酵改善木薯渣品质的研究［J］.动物营养学报，2014，26（7）：2026-2034.

［13］李艳芳，郝建雄，程永强，等.黑曲霉和米曲霉发酵改善豆渣口感［J］.农业工程学报，2012，28（7）：248-253.

［14］罗建平，王贵娟，潘利华.黑曲霉发酵麦麸生产β-葡萄糖苷酶的工艺优化及动力学研究［J］.农业工程学报，2007，23（12）：252-257.

Process Oprimization on Tendering Mushroom Stem Using Aspergillus oryzae Fermentation Liquid by Response Surface

WEI Shu-xin，WANG An-jian，ZHU Guang-cheng，GAO Shuai-ping，LI Shun-feng，TIAN Guang-rui
（Institute of Agricultural Products Processing of Henan Academy of Agricultural Science，Zhengzhou 450002，China）

Using the by-products mushrooms stem as raw materials，and the Aspergillus oryzae fermentation liquid as tender agent，by single factor experiment and response surface method，the optimum process of A.oryzae fermentation liquid tendering mushrooms stem was obtained，such as fermentation concentration 30.4%，pH nature，processing temperature 53℃，processing time 4.8 h.Under this condition，the chewing of the mushroom stem was 16.25 mJ.The results showed that the tender effects of A.oryzae fermentation liquid on mushroom stem was good and this provided a new way for the deep development for mushroom stem.

Aspergillus oryzae；fermentation liquid；mushrooms stem；tender

S646.1

A

1003-8310（2016）03-0050-05

10.13629/j.cnki.53-1054.2016.03.011

河南省农业科学院自主创新专项基金（2015ZZ48）。

魏书信（1972-），男，硕士，副研究员，主要从事农副产品保鲜与加工技术研究。E-mail：hnnkyjgs@163.com

2016-03-16