肝素提取中膜分离回收固定化胰蛋白酶的工艺研究

2016-11-18 09:23于海宁沈生荣单伟光
浙江工业大学学报 2016年5期
关键词:解液陶瓷膜肝素钠

于海宁,张 鹏,沈生荣,单伟光

(1.浙江工业大学 药学院,浙江 杭州 310014;2.浙江大学 生物系统工程与食品科学学院,浙江 杭州 310058)



肝素提取中膜分离回收固定化胰蛋白酶的工艺研究

于海宁1,张 鹏1,沈生荣2,单伟光1

(1.浙江工业大学 药学院,浙江 杭州 310014;2.浙江大学 生物系统工程与食品科学学院,浙江 杭州 310058)

以微滤膜分离肝素酶解液,回收固定化胰蛋白酶,研究蛋白酶重复提取肝素,具有较大的经济价值.通过单因素试验和正交试验,研究膜组件运行参数对膜分离回收固定化酶工艺的影响,通过考察肝素透过率、固定化胰蛋白酶拦截率、平均膜通量和膜通量恢复率为指标,获得膜分离回收固定化胰蛋白酶的最佳工艺条件和清洗陶瓷膜的最佳NaOH浓度.实验结果表明:在最佳膜分离条件下,固定化酶和肝素能够有效分离,平均膜通量达到656.13 L/(m2·h),在该条件下回收的固定化胰蛋白酶仍具有良好的活性,可重复利用.采用最佳的2%NaOH溶液清洗陶瓷膜,陶瓷膜平均通量恢复至初始通量的97.9%.

肝素;固定化酶;陶瓷膜

肝素(heparin)是一种由葡萄糖胺,L-艾杜糖醛苷、N-乙酰葡萄糖胺和D-葡萄糖醛酸交替组合的具有不同链长的多糖链混合物[1].由于具有很强的抗凝血因子Xa和Ⅱa的能力,在抗凝血药物中肝素使用量最大,占据一半以上抗凝血类药物市场份额.肝素原料药主要从猪的肠黏膜中提取[2].我国每年的牲畜屠宰量十分巨大,拥有极其丰富的肝素原料药资源,年均粗品肝素出口量占世界领先位置.目前肝素的制备方法主要是盐析+树脂吸附法[3].传统的盐析法用于肝素提取不但得率低,还会产生大量的含盐废水,对环境造成较大的污染.

近年来,酶解法提取肝素的工艺研究有少量报道[4-6],具有大幅度减少废水排放,提取率高的优点.单纯游离酶对环境要求较高,且因无法回收而造成生产成本大大提高.与游离酶相比,固定化酶具有稳定性高、可重复利用等显著优势[7-9].膜分离技术具有节能、高效、可以在常温下进行、适应性强、分离过程不存在相变等诸多优势[10-14]. 本课题组将固定化胰蛋白酶技术应用于肝素提取,胰蛋白酶的稳定性提高,且能够回收重复利用,可以大大降低酶解法提取肝素的生产成本.将膜分离技术用于回收肝素酶解液中固定化胰蛋白酶,实现固定化胰蛋白酶连续提取肝素的方法尚未见报道.笔者首次研究了膜分离肝素酶解液,回收固定化胰蛋白酶的工艺条件,以期为肝素连续化、清洁化生产提供依据.

1 材料与仪器

1.1 材料和试剂

猪胰蛋白酶和20 nm二氧化硅购自阿拉丁;标准绵羊血浆购自上海卒瑞生物科技有限公司;猪小肠由浦江凯瑞生物技术有限公司提供,其余所用试剂均为分析纯.

1.2 仪器与设备

陶瓷膜小试设备(厦门福美科技有限公司);85-1磁力搅拌器(上海志威电器有限公司); T25DS25均质机(德国IKA公司);ST16R台式高速冷冻离心机(赛默飞世尔科技有限公司);DK-S24电热恒温水浴锅(上海精宏实验设备有限公司).

2 实验方法

将新鲜猪小肠洗净后刮取肠粘膜,加入一定量蒸馏水匀浆至无明显颗粒后,加入一定量固定化酶进行酶解.提取结束后使用无机陶瓷膜对提取液进行微滤,收集滤过液,回收滤渣用于下一次重复提取,工艺流程如图1所示.

图1 肝素提取工艺流程Fig.1 Technological process of heparin extraction

2.1 材料预处理

将新鲜猪小肠洗净,刮取得猪小肠黏膜.将50,100,200,500,800 nm的陶瓷膜用蒸馏水浸泡24 h后,循环蒸馏水至水通量稳定,备用.

2.2 固定化酶制备

取胰蛋白酶,加入100 mL蒸馏水,搅拌均匀制得酶液.加入纳米二氧化硅,m(酶)∶m(载体)=1∶25,在磁力搅拌下固定一段时间,离心,即得固定化酶.采用福林酚法测定蛋白酶活力,参照GB/T 23527—2009《中华人民共和国国家标准蛋白酶制剂附录B》.

2.3 肝素效价的测定

采用冷冻羊血浆法[15]检测肝素效价.取肝素钠标准品(185 U/mg)适量,配置成每1 mL含肝素钠100 U的标准液,临用时用生理盐水稀释至10 U/mL.在试管中加入不同体积的肝素钠标准溶液,分别加入1 mL绵羊血浆和0.8 mL 0.25%氯化钙溶液,上下倒转试管,使内容物混和均匀,放入(37±1) ℃水浴中保温,1 h后取出,当试管内羊血浆达到半凝固度时,记录其所用肝素钠标准溶液的体积,记为Vstd.同样方法测定供试品V1/2,供试品的效价单位计算式为

式中:Vstd为血浆达到半凝固度时肝素钠标准溶液加入的体积,μL;Cstd为肝素钠标准品溶液的浓度,U/mL;Vstm为血浆达到半凝固度时供试品肝素溶液加入的体积,μL;Wsam为供试品质量,mg;V为供试品总体积,mL.

2.4 酶 解

将上述的小肠粘膜加入适量蒸馏水后匀浆至无明显颗粒,用NaOH调pH=11,加入质量分数为0.24%的固定化酶,控制料液比为1∶3.3,46 ℃下酶解5 h,纱布过滤除去残渣,得肝素酶解液.

2.5 陶瓷膜分离单因素实验

2.5.1 膜孔径的选择

将预处理的50,100,200,500,800 nm孔径的陶瓷膜,在压力0.2 MPa,温度30 ℃,流速2 m/s过滤肝素酶解液,测定90 min内的平均膜通量,检测滤过液的效价.

2.5.2 操作压力的选择

选用800 nm孔径的陶瓷膜,在0.15,0.20,0.25,0.30,0.35 MPa的操作压力下过滤肝素酶解液,测定90 min内的平均膜通量.温度30 ℃,流速2 m/s,pH=11.

2.5.3 温度的选择

选用800 nm微滤膜,在30,35,40,45,50 ℃下过滤肝素酶解液,测定90 min内的平均膜通量.压力0.3 MPa,流速2 m/s,pH=11.

2.5.4 流速的选择

选用800 nm微滤膜,分别在流速1.25,1.5,1.75,2,2.25 m/s的条件下进行肝素钠微滤,测定90 min内的平均膜通量.压力0.3 MPa,温度40 ℃,pH=11.

2.5.5 料液pH的选择

将pH分别为7,8,9,10,11的肝素料液过800 nm微滤膜,测定90 min内的平均膜通量.压力0.3 MPa,温度40 ℃,流速2 m/s.

2.6 正交优化膜分离参数

在单因素实验的基础上,选取操作压力、温度、流速、料液pH作为影响因素,以平均膜通量为指标,设计4因素3水平正交实验,正交实验因素水平设计如表1所示.

表1 正交实验因素水平表

Table 1 Factors and levels of orthogonal test

水平A1)/MPaB2)/℃C3)/(m·s-1)D4)10.25351.75920.30402.001030.35452.2511

注:1) 操作压力;2) 温度;3) 流速;4) pH值.

2.7 重复利用固定化酶

将固定化酶回收后,再次酶解肝素,相同条件下重复5次,检测每次提取液的肝素效价.

2.8 陶瓷膜的清洗再生

采用质量分数分别为0.5%,1%,2%,3%的NaOH溶液对陶瓷膜进行清洗,计算清洗前后陶瓷膜的水通量,比较不同浓度碱液的清洗效果.

3 结果与分析

3.1 陶瓷膜分离单因素实验结果

由表2可知:膜的孔径越大,肝素酶解液的平均膜通量越大.当膜孔径为50,100,200 nm时,固定化酶和肝素基本都没有透过膜;孔径为500 nm和800 nm时,肝素透过率为79%和92.5%,固定化酶基本被截留.基于分离效率考虑,选择最佳膜孔径为800 nm.

表2 膜孔径对分离效果的影响

由图2(a)可知:在压力0.15 ~0.3 MPa之间,压力越大,膜通量越大;而当压力高于0.3 MPa时,由于过高压力使膜表面剪切力变小,导致浓差极化现象严重,膜通量反而降低,而且过高的压力会导致系统运行不稳定.因此,本实验中选择操作压力为0.3 MPa.当温度在30~40 ℃之间时,料液温度越高,膜通量衰减越小,平均膜通量越大.当温度高于40 ℃时,膜通量变化不明显,而过高的温度不但会影响肝素的效价,也会导致部分固定化酶失活.因此,本实验选择操作料液温度为40 ℃.

由图2(b)可知:在一定压力下,增加膜表面流速,能够增大膜表面剪切力,降低膜污染的风险,增大膜通量.当流速在1~2 m/s时,流速越大,膜通量衰减越小,平均膜通量越大.但当流速超过2 m/s时,由于流速过大,料液回流时产生大量气泡,导致肝素酶解液通过膜组件时产生过大的压力降,影响分离效率,平均膜通量反而下降.因此,本实验选择2 m/s作为最佳流速.料液pH值对微滤时的膜通量几乎没有影响.由于肝素在酸性环境中不稳定,因此本实验选择肝素提取液的pH条件,即pH=11.

图2 不同因素对平均膜通量的影响Fig.2 Effects of different factors on average volume flow of solution through membrane

3.2 正交实验结果

由表3可知:RB>RA>RC>RD,即温度对肝素酶解液膜分离通量影响最大,操作压力次之,pH影响最小.在操作压力的影响中,K2影响最大;在温度的影响中,K3影响最大,考虑K2与K3接近,温度过高对肝素效价和固定化酶的活性有较大影响,故选择K2为最优;在流速的影响中,K2影响最大;在pH的影响中,K1,K2,K3几乎没有差别,考虑到工艺简便,选择K3为最优.综上,正交实验的最优组合为A2B2C2D3.

表3 正交实验结果

3.3 验证实验

用800 nm陶瓷膜在操作压力0.3 MPa,温度40 ℃,流速2 m/s,pH 11条件下过滤肝素酶解液,平行进行3组实验,测得平均膜通量分别为656.40,661.82,650.16 L/(m2·h),平均值为656.13 L/(m2·h),明显大于正交实验中的平均膜通量,证明该结果合理可靠.

3.4 固定化酶重复利用次数

固定化酶酶解肝素后回收再次进行酶解,重复5次.重复提取3次后,肝素提取率下降17.3%,再重复提取2次,肝素提取率趋于平稳,仅下降6.5%,并且由于固定化酶初次回收时会有小部分损失,从而对肝素提取率有一定影响,所以固定化酶重复酶解肝素的提取效果良好.

3.5 不同质量分数碱液清洗陶瓷膜效果

由表4可知:被污染的陶瓷膜经一定质量分数NaOH溶液清洗后通量恢复到一定程度.相比较而言,0.5%NaOH清洗效果最差,通量回复率达不到理想的85%的理想值,而2%和3%的NaOH清洗效果都取得了理想效果,而两者效果差别不大,因此选用2%NaOH溶液可以作为最佳陶瓷膜清洗液.

表4 不同质量分数 NaOH溶液洗膜效果

4 结 论

利用膜的选择透过性,有效地将肝素与固定化酶分离,固定化酶拦截率达到100%,肝素透过率达到92.5%;以平均膜通量为指标,获得肝素固定化酶解液最佳分离工艺:使用孔径为800 nm的陶瓷膜过滤肝素固定化酶解液,在操作压力0.3 MPa,温度40 ℃,流速2 m/s,pH=11条件下,平均膜通量达到656.40 L/(m2·h).使用2%NaOH溶液清洗被污染的陶瓷膜,其通量能恢复到初始通量的97.9%.本研究对于酶膜耦合技术在肝素生产上的应用,实现肝素连续化、清洁化生产,降低能耗,解决现阶段国内肝素生产污染问题有重要意义.

[1] 任红媛,何泼,李红心.猪小肠粘膜中肝素钠提取与精制工艺研究[J].食品研究与开发,2012,28(1):78-80.

[2] 姬胜利,桑青,张天民. 肝素的来源控制、结构分析以及结构与生物活性关系的研究进展[J].中国药学杂志,2012,47(9):660-663.

[3] 王庆元. 肝素钠工艺研究[J].中国医药工业杂志,1991,2(5):201-202.

[4] 宋大巍,李雷刚,张丽萍.胰蛋白酶水解法提取肝素工艺参数的优化研究[J].黑龙江八一农垦大学学报,2008(3):72-77.

[5] 徐俊涛. 酶解法制备肝素钠关键工艺技术研究[D]. 郑州:河南农业大学,2012.

[6] FEMANDO L G,LORENA B, CESAR M.Enzyme stabilizationby glutaraldehyde crosslinking of adsorbed proteinson aminated supports[J].Journal of biotechnology,2005,119(1):70-75.

[7] 易喻,李慧娟,陈建澍,等. 纸纤维固定木瓜蛋白酶的研究及应用[J]. 浙江工业大学学报,2013,41(2):147-151.

[8] 钱俊青,吕坚方. 壳聚糖水凝胶的制备工艺对其吸附蛋白质的影响[J].浙江工业大学学报,2011,39(4):395-399.

[9] 钱俊青,蒋盛蓝,秦德怀,等.214型离子交换树脂固定化假丝酵母脂肪酶的研究[J].浙江工业大学学报, 2013,41(3): 244-250.

[10] 任建新. 膜分离技术及其应用[M]. 北京:化学工业出版社,2003.

[11] FIORINI M.Preparative high-performance liquid chromatography for the purification of natural anthyocyanins[J].Journal of chromatography A,1995,692(1/2):213-219.

[12] DAVIS R H. Modeling of fouling of crossflow microfiltration membranes[J]. Separation& purification reviews,1992,21(2):75-126.

[13] 童汉清,海金萍.膜分离技术及其应用[J]. 化工装备技术,1999(2):19-20.

[14] 海文英.酶法结合膜技术制备精品肝素钠的工艺研究[D].武昌:湖北工业大学,2013.

[15] 孟长虹,陆益红.肝素钠及其制剂测定方法的改进[J].中国生化药物杂质,2008,29(5):337-339.

(责任编辑:刘 岩)

Research on preparation of heparin with immobilized enzyme combined with membrane technology

YU Haining1, ZHANG Peng1, SHEN Shengrong2, SHAN Weiguang1

(1.College of Pharmaceutical Science, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310014, China;2.School of Biosystems Engineering and Food Science, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China)

Using microfiltration membrane to separate heparin enzymolysis liquid and retrieve immobilized trypsin has a great economic value. Through single factor experiments and orthogonal experiments, heparin transmittance, trypsin interception rate, average volume flow of solution through membrane and membrane flux recovery rate were used as indicators to investigate the optimal concentration of NaOH and the optimal conditions of membrane separation. The result showed that under the optimal conditions, heparin and trypsin can be separated effectively. The average volume flow of solution through membrane was 656.13 L/(m2·h). Using 2%NaOH, the membrane could recover about 97.9% of the initial flux.

heparin; immobilized enzyme; ceramic membrane

2016-01-13

浙江省科技厅重大科技专项资助项目( 2014C03015)

于海宁(1977—),女,山东潍坊人,副教授,研究方向为天然药物,E-mail:yuhaining@zjut.edu.cn.

R931.6

A

1006-4303(2016)05-0515-04

猜你喜欢
解液陶瓷膜肝素钠
多糖类肝素湿品沉淀可保存时长的研究
金属元素Cu、Fe对肝素钠氧化过程的影响
烧结制度对粉煤灰-黄土基陶瓷膜支撑体性能的影响
水产品酶解液中重金属脱除技术研究进展
4种龟肉酶解液的氨基酸及呈味特性比较
负离子材料陶瓷膜
热处理温度对氧化石墨烯改性陶瓷膜油水分离性能的影响
基于专利分析的陶瓷膜技术发展态势研究
水解度对牡蛎酶解液特性的影响
电子舌在甲鱼酶解液滋味评定中的应用