烟台黑猪SLA-DQA基因编码区多态性及生物信息学分析

黄晓宇,袁军虎,杨巧丽,马艳萍，滚双宝,3

(1.甘肃农业大学 动物科学技术学院,甘肃 兰州 730070;2.河南省漯河市畜牧局,河南 漯河 462000;3.甘肃省现代养猪工程技术研究中心,甘肃 兰州 730070)



烟台黑猪SLA-DQA基因编码区多态性及生物信息学分析

黄晓宇1,袁军虎2,杨巧丽1,马艳萍1，滚双宝1,3

(1.甘肃农业大学 动物科学技术学院,甘肃 兰州 730070;2.河南省漯河市畜牧局,河南 漯河 462000;3.甘肃省现代养猪工程技术研究中心,甘肃 兰州 730070)

采用 PCR-SSCP、克隆测序和生物信息学等方法对烟台黑猪SLA-DQA基因多态性进行研究,预测其蛋白质结构并分析其功能特征。结果显示:SLA-DQA基因 exon 2、exon 3、exon 4 分别检测出4 种等位基因,5 种基因型、6 种等位基因,8 种基因型、4 种等位基因,7 种基因型,包括3种新等位基因。SLA-DQA基因共编码 255 个氨基酸,编码区共发现 32 个核苷酸突变和 13 个氨基酸变异,exon 2 多态性最为丰富。蛋白质结构预测结果显示二级结构中无规则卷曲和延伸链比例最高,α 螺旋数量多且集中,β 折叠最少。功能预测结果显示，SLA-DQA基因蛋白质在能量代谢、结构蛋白和生长因子等方面几率较高。本研究结果可为SLA-DQA基因在猪抗病分子育种中的应用提供理论依据。

烟台黑猪;SLA-DQA基因;编码区;多态性;蛋白质结构

猪的主要组织相容性复合体即猪白细胞抗原复合体(Swine lymphocyte antigen,SLA),是猪染色体上一组紧密连锁、与免疫应答和抗病性密切相关的高度多态的基因群。SLA抗原定位于 7p12-q12,按其抗原结构和功能主要分为三大类,其中 Ⅱ 类抗原位于SLA-D区,是由34 kDa 的 α 链和 29 kDa 的 β 链以非共价键结合的异质二聚体,主要包括DRA、DRB、DQA、DQB、DOB、DPA、TAP、LMP等基因[1-3]。SLAⅡ类DQA和DRA基因位于抗原呈递细胞(APC)表面,能够将抗原呈递给 CD4+T细胞,从而参与并调控机体的免疫应答反应。基因产物间的变异是特异的抗原结合和排斥反应的基础,抗原结合位点的多态性可确定免疫识别相关的功能性多态,在研究机体的抗病能力方面具有非常重要的作用。SLA基因是猪染色体中最富有特性的区域，大量研究表明,具有SLAⅡ 类基因不同基因型的个体对疾病抵抗能力具有明显差异,不同DQA和DRA基因型显著影响仔猪腹泻情况[4-9]。研究显示不同地域品种猪有各自独特的生物多样性和遗传稳定性特征,使得不同地域特征性的猪种SLAⅡ 基因表现出不同程度的多态性,人们通过克隆测序等技术对广西巴马猪、海南五指山猪、八眉猪、荣昌猪及湖南沙子岭猪等不同地域猪种SLAⅡ类基因DQ和DR基因的多态性水平、蛋白质结构和功能、同源性进行分析[10-14],发现猪SLA与人类HLA基因之间具有高度的同源性,这种相对低度的免疫排斥反应,将有助于猪-人异种器官移植免疫排斥反应的研究,但目前尚未见到对烟台黑猪SLAⅡ类基因多态性的报道。

烟台黑猪始产于胶东半岛,是以胶东地方灰皮黑猪为基础,经选育而成的一种优良猪种,具有耐粗饲、易饲养、抗逆性强、产仔率高等特点,对当地生猪生产和品种改良起到了重要作用,又因其猪肉品质、色泽、口感及风味较好,近年来更是倍受消费者青睐[15]。因此,探讨烟台黑猪腹泻的抗病性或易感性对于更好地利用其品种资源优势具有重要意义。

试验以甘肃红古区引入的烟台黑猪为研究对象,采用 PCR-SSCP、克隆测序和生物信息学软件等方法,研究烟台黑猪SLA-DQA基因编码区(Coding region,CDS)多态性,氨基酸组成并对其CDS 蛋白质的结构和功能进行预测分析,以期探究烟台黑猪SLA-DQA基因的遗传特性、蛋白质结构和功能的关系以及其作为候选基因在猪抗病育种方面的潜力,为今后在猪遗传育种候选基因的研究提供一定可靠的理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验对象为甘肃省红古区黑猪饲养场饲养条件相同的 290头烟台黑猪。采集耳组织样品约 3 g 置于盛有 75% 乙醇的 5 mL EP 管中,并在 DNA 降解前立即送到实验室保存于-20 ℃。根据 Sambrook等[16]的常规酚/氯仿抽提法提取基因组 DNA,TE 溶解,用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测 DNA 的纯度和浓度,再稀释成终浓度为 100 ng/μL 置于-20 ℃ 保存备用。

1.2 引物设计和 PCR 扩增

参照 NCBI 数据库SLA-DQA基因序列 (登录号 AY 303988),采用 Primer 5.0 引物设计软件设计SLA-DQA基因 exon 2、exon 3、exon 4 扩增引物,预期扩增片段分别为 378,388,278 bp,引物由大连宝生物公司合成。引物序列参见表 1。

表1 SLA-DQA 基因 exon 2、exon 3、exon 4 的引物序列和 SSCP 反应条件

PCR 扩增采用 25 μL 的反应体系:10×Buffer 缓冲液 2.5 μL,dNTP 1 μL(2.5 mmol/μL),上下游引物各 0.5 μL(10 pmol/μL),TaqDNA聚合酶0.5 μL(5 U/μL),模板 DNA 1 μL(50～100 ng/μL),灭菌 ddH2O 19 μL。PCR 扩增条件:预变性 94 ℃ 3 min;变性 94 ℃ 30 s,退火温度详见表 1,延伸 72 ℃ 30 s,35 个循环;最后延伸 72 ℃ 10 min,4 ℃ 保存,PCR 产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 PCR 扩增产物的 SSCP 检测

分别取 3 μLSLA-DQAPCR 产物,加入 7 μL 变性剂(98% 去离子甲酰胺、0.025% 溴酚蓝、0.025% 二甲苯青、10 mmol/L EDTA(pH 值0.8)混合),经 98 ℃变性 10 min,迅速冰浴 10 min,上样于充分预冷的 10% 非变性聚丙烯酰胺凝胶(Acr∶Bis=39∶1),SLA-DQA基因3个外显子 PCR 扩增产物混合液 4 ℃ 条件下进行电泳,电泳条件见表 1,电泳结束后银染法显色。

1.4 基因的克隆测序

根据不同 SSCP 模型条带,每种基因型随机挑取 3 个不同个体的 PCR 产物,用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收纯化,纯化后的产物用载体pMD®19-T Vector 连接,构建重组质粒,并转化大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5α 菌株;挑选阳性克隆培养,培养后进行菌液 PCR 扩增;菌液 PCR 产物与初始 PCR 产物同时进行 SSCP 检测,再次通过 10% 的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(39∶1),显色后进行模型条带比较,进一步确定测序菌落的正确性,每一种基因型挑选 2 个克隆的菌液 PCR 产物送上海生物工程有限公司进行测序。

1.5 数据统计分析

PopGene 32 软件和 PIC软件(Bostein)[17]计算基因的多态性信息,MEGA 5.0 软件进行 DNA 分析和比对;NCBI dbSNP 数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.html)分析单核苷酸多态性;利用 CBS的 Protfun在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun)预测蛋白质的功能;ExPASY 服务器 SWISS-MODEL(http://us.expasy.org/)预测蛋白质二级结构,三维结构同源建模和模型分析。

2 结果与分析

2.1SLA-DQA基因核苷酸序列多态性分析

2.1.1 PCR 扩增及 SSCP 检测SLA-DQA基因 exon 2、exon 3、exon 4 的 PCR 扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测,目的条带清晰且无非特异扩增者,判断其扩增产物为目的基因,可进行后续试验分析。经 SSCP 检测,exon 2 检测到 4 种等位基因(A、B、C、D),共形成 5 种基因型(AA、BB、AB、AC、AD,图 1-A);exon 3 检测到了 6 种等位基因(A、B、C、D、E、F),共形成 8 种基因型(AA、BB、AB、CC、BC、DD、EF、CF,图 1-B);exon 4 检测到了 4 种等位基因(A、B、C、D),共形成 7 种基因型(AA、BB、AB、CC、BC、AD、BD,图 1-C)。3个外显子的等位基因频率和基因型频率见表 2。

2.1.2SLA-DQA基因 exon 2、exon 3、exon 4 的序列分析 根据参考序列(AY303988),将克隆测序得到的序列去除引物序列及内含子序列,得到有效的外显子序列,exon 2、exon 3、exon 4 序列长度分别为 249,281,154 bp。将3个外显子的等位基因序列利用 dbSNP 进行比对,结果发现 exon 2、exon 3、exon 4 序列分别检测到 20,9,3 个核苷酸突变位点(表 3),共导致 13 个氨基酸发生变异。SLA-DQA基因3个外显子中共包括3种新等位基因：exon 2 中 D等位基因含有7个核苷酸突变位点,exon 3 中 C等位基因包括一个新的突变位点(c.4828T>C),F等位基因包含一个新的突变位点(c.4617T>C)。各等位基因序列提交至GenBank,获得的登录号见表2。核苷酸的突变引起氨基酸的变异,exon 2中D等位基因含有7个核苷酸的突变位点,导致3个氨基酸发生变异,c.3945C>T导致了脯氨酸转化为丝氨酸,c.4086A>G导致了苏氨酸转化为丙氨酸,c.4099A>C的突变导致了天冬酰胺转化为苏氨酸;exon 3中C等位基因c.4828T>C的变异导致半胱氨酸转化为精氨酸,F等位基因c.4617T>C导致丝氨酸转化为脯氨酸,均属于错义突变。

SLA-DQA基因exon 2(A)、exon 3(B)、exon 4(C)分别检测到 5,8,7 个SSCP不同的带型。每种带型代表一种基因型。

位置Locus等位基因Allele基因型Genotype登录号AccessionNo.频率Frequencies频率Frequencies杂合度Ne有效等位基因数He多态信息含量PIC外显子2A已知 KM4119710.71(412)AA0.46(133)0.391.650.43exon2B已知 KM4119720.15(87)BB0.04(12)C已知 KM4119730.08(46)AB0.22(64)D新发现KM4119740.06(35)AC0.16(46)AD0.12(35)外显子3A已知 KM4855550.09(50)AA0.04(12)0.382.630.58exon3B已知 KM4855560.56(325)BB0.40(116)C新发现KM4855570.15(87)AB0.10(29)D已知 KM4855580.04(23)CC0.02(6)E已知 KM4855590.15(87)BC0.23(67)F新发现KM4855600.01(6)DD0.04(10)EE0.15(44)CF0.02(6)外显子4A已知 KM4855510.55(319)AA0.47(138)0.392.550.54exon4B已知 KM4855520.28(162)BB0.18(54)C已知 KM4855530.11(64)AB0.08(22)D已知 KM4855540.06(35)CC0.08(24)AD0.07(20)BC0.06(16)BD0.06(16)

2.1.3SLA-DQA基因 exon 2、 exon 3、 exon 4 遗传多态性分析 烟台黑猪SLA-DQA基因 exon 2、exon 3、exon 4 的基因型和等位基因频率见表 2。遗传杂合度(He)、有效等位基因数(Ne)和多态信息含量(PIC)是评价群体遗传变异的重要指标,不同的遗传参数体现各群体的遗传差异性。由表 2可以看出,烟台黑猪SLA-DQA基因3个外显子的 He 值为1.65～2.63,杂合度较高;根据 Vaiman 等[18]的研究结论,exon 2的PIC值为 0.43,表现为中度多态性(PIC<0.50),exon 3、exon 4 的PIC值分别为 0.58,0.54,表现为高度多态性(PIC>0.50)。

表3 烟台黑猪 SLA-DQA 基因 exon 2、exon 3、exon 4 突变位点

注:方框标记为新突变位点。

Note:The box marked are the novel mutation sites.

2.2SLA-DQA基因 CDS 区蛋白质的结构功能预测

2.2.1SLA-DQA基因蛋白质功能特性预测 对比 GenBank 数据库SLA-DQA基因的参考序列登录号AY303988，烟台黑猪SLA-DQA基因CDS核苷酸序列长度为768 bp，共编码255个氨基酸，SLA-DQA基因与AY303988的CDS氨基酸对比结果详见图 2。SLA-DQA基因与 AY303988 的 CDS 蛋白质功能预测详见表 4,由表 4可以看出，预测的磷酸化位点,转移数差异较大,能量代谢、结构蛋白、脂肪酸代谢和等电点数值均较高。SLA-DQA基因蛋白质的二级结构预测见图 3,其中 α 螺旋率 22.35%(57个),β 折叠率6.67%(17个),无规则卷曲率 40.00%(102个),延伸链率为 30.98%(79个)。

箭头标记的氨基酸为配位体,由氨基酸序列的第144位天冬酰胺(N),192位谷氨酸(E)和193位组氨酸(H)组成。

功能类别FunctionalcategorySLA-DQA AY303988 氨基酸生物合成Aminoacidbiosynthesis0.4140.567能量代谢Energymetabolism2.3412.313转化Translation -1.117信号转导Signaltransducer0.3980.390受体Receptor0.0440.047结构蛋白Structuralprotein5.6485.830转录Transcription1.7151.708离子通道Ionchannel0.1470.147生长因子Growthfactor5.5645.564预测的磷酸化位点Putativephosphorylationsites10个(93、155、231、335、416、473、474、557、712、741)14个(93、155、172、173、231、335、354、355、416、473、474、557、712、741)信号肽概率Signalpeptideprobability0.8590.859信号锚概率Signalanchorprobability0.0490.049脂肪酸代谢Fattyacidmetabolism1.2651.265等电点Isoelectricpoint5.095.09

c.无规则卷曲区;e.延伸链区;h.α-螺旋区;t.β-折叠区。

2.2.2SLA-DQA基因蛋白质三级结构的同源建模 通过在线软件 SWISS-MODEL 数据库 Blast 进行分析,以序列 3pl6.1.A(2.55Å)[19]为模板,对提交的SLA-DQA基因氨基酸序列进行蛋白质三维结构同源建模,预测了第 25-206 位氨基酸的三维结构,占氨基酸总长度的70.6%，模型结果见图 4。SLA-DQA基因与模板序列相似性为 0.55%,序列覆盖率为 76%,序列一致性达到 80.93%。全球模型质量评估(GMQE)得分为 0.69[20-21]。试验发现1个 N-糖蛋白配位体(N-Acetyl-D-Glucosamine,NAG),分子式为 C8H15NO6,分子量为 221.208 g/mol。在SLA-DQA基因蛋白质的三维结构模型中还预测到一个配位体，该配位体是由蛋白质序列上的第144位N(天冬酰胺)，第192位E(谷氨酸)和第193位H(组氨酸)3个氨基酸组成(图2， 4)。

图4 烟台黑猪 SLA-DQA基因蛋白三级结构模型预测

2.2.3SLA-DQA基因三维结构合理性分析 运用 DeepView 软件拉式构图检测模拟SLA-DQA基因蛋白质三维模型的合理性。模拟蛋白质三维模型包括 182 个氨基酸,其中 178 个氨基酸残基(97.8%)的二面角落在允许的范围内(a区域),仅有 4 个氨基酸残基(2.2%)的二面角落在不允许范围内(a区域外,b区域内为不完全允许区，c区域内为不允许区)(图 5)。结果表明，SLA-DQA基因的三维模型的二面角分布和立体构象合理,均符合立体化学的二面角 (φ,ψ)分布要求。

a.允许区;b.临界限制区;c.不允许区。

3 讨论与结论

猪的SLA基因是基因组中最具遗传多态性的基因,截至目前,在猪的 MHC数据库中仅定义了 20DQA、44DQB、13DRA、82DRB1 种等位基因,相较于 β 链DQB和DRB基因的高度多态性,α 链DQA基因一般呈现出中等程度多态性,这种核苷酸的多态性将会导致相应氨基酸的变化,可能会影响SLAⅡ类 α 链基因的功能[22],较低的DQA基因多态性可能是由降低的积极选择压力造成的[2]。自然选择过程中等位基因的积累和融合、生存环境、个体对外来抗原的选择压力的差异以及病原体驱动下的核苷酸替换都有利于等位基因多态性的进化[23],通过MHC基因的变异对蛋白质结构和功能进行分析和预测,可有效地评估种群遗传多样性水平,为更加深入的研究SLA-DQA基因作为疾病和生产的候选基因提供理论基础。

本试验在SLA-DQA基因 CDS 区共检测到 32 个SNPs,具有丰富的遗传多态性。其中 exon 2 检测 4 种等位基因和5种基因型(AA、BB、AB、AC和AD),没有检测到 BC 型,与孔晶晶[24]的研究结果相比,发现有2种基因型完全一致,2种等位基因不相同,进一步说明SLA-DQA基因外显子 2 具有非常丰富的多态性。SLA-DQA基因的3个外显子多态性分布极不平衡,exon 2 包括20 个核苷酸变异位点,A 等位基因频率为 0.71,属于优势等位基因,多态性最丰富,exon 3 和 exon 4 分别包括 9,3 个核苷酸变异位点,exon 3 中 B 等位基因和 exon 4 中 A等位基因的基因频率分别为0.56和0.55,高于其他等位基因频率,属于优势等位基因,exon 3 和 exon 4 基因多态性较低,这种现象可能与基因的保守性有关。保守性机制是由基因在动物机体担任重要功能所决定,具有调节和控制机体的免疫应答、抵御外源环境压力、维持正常生理功能和自身进化的作用。烟台黑猪作为地方性选育猪种,长期受到人工选择的压力作用,打破了个体交配的随机性,造成基因分布的不平衡,使得某种基因型成为特定基因位点的优势基因型。SLA-DQA基因 exon 2 的 PIC值为 0.25～0.50。表现为中度多态,这与Liu 等[5]、Yang等[8]、Ho等[22]和 Lunney等[1]的研究结果一致。MHC 基因组外显子功能区碱基的变异将导致功能区氨基酸的突变,从而影响蛋白质的稳定性,最终在抗原的识别与递呈、免疫应答与调控等方面发挥作用。

本试验中SLA-DQA基因氨基酸序列包含α螺旋、β折叠、无规则卷曲和延伸链的氨基酸数分别为 57,17,102,79个。α 螺旋和 β 折叠2种结构均含有氢键,键能较高,能够牢固地维持蛋白质的高级结构且常位于蛋白质的内部;延伸链和无规则卷曲区域所占比例最高,属柔型结构,易发生扭曲,常出现于蛋白表面并与表面抗原结合。SLA-DQA基因与 AY303988 编码蛋白的能量代谢、脂肪酸代谢、信号转导、生长因子的几率均呈现相对较高现象(表 4),其中结构蛋白和生长因子的几率最高,说明该基因可能对猪的抗原结合能力和生产力起到较高的调节作用[23]。

同源建模是一种根据蛋白结构保守稳定性远大于蛋白氨基酸序列的理论预测蛋白质三维结构的方法,如果氨基酸序列相似性达 30% 以上,则可用已知蛋白结构作为模板[21,25]模拟蛋白质三维结构。本试验中预测的SLA-DQA基因蛋白质三维结构只含有一条 α 链,由第 25-206 位氨基酸组成 α 链的编码区,占编码氨基酸总长度的 70.6%,是蛋白质行使生物功能的主要区域。SLA-DQA基因三维结构合理性分析中,α-螺旋主要出现在坐标轴的第三象限,β-折叠主要出现在第二象限,且均在a区域内,说明所形成的二面角(φ,ψ)构象能量最低且稳定,符合立体化学所允许的构象图。对蛋白质分子高级结构的研究有助于阐明SLA分子与多肽的结合规律及其免疫应答的特征,使人们对SLA-DQA基因蛋白的生物分子结构更加直观、形象,便于今后深入探究SLA-DQA的致病机理、免疫机制等分子生物学功能的结构基础。

配位体能够提供电子与中心原子反应,保护中心原子的官能团而稳定化合物。本试验中预测到一个配位体,由 α 链上第 144 位 N(天冬酰胺),第 192 位 E(谷氨酸),第 193 位 H(组氨酸)形成,可与 NAG 接触产生反应形成髓鞘碱性蛋白多肽(Myelin basic protein peptide,MBP)结合位点。MBP 是脊椎动物中枢神经系统髓鞘的主要蛋白质,位于髓鞘浆膜面,能够维持髓鞘结构和功能的稳定性,具有神经组织特异性。1962 年,Laatsch 等[26]首先从豚鼠脑中分离出 MBP,血清中 MBP 的含量可作为判断 CNS 破坏程度的重要指标。信号肽是蛋白多肽链中用于指导蛋白质跨膜转移(定位)的 N-末端的氨基酸序列,一般由 15～30 个氨基酸组成,蛋白成熟后信号肽将被剪切掉。该试验中没有预测到信号肽存在,这个结果可避免试验中所预测到的 N-糖基化位点,磷酸化位点和抗原表位等落在信号肽区域而被剪切掉。蛋白质的糖基化是最重要的翻译后修饰之一,与蛋白质结构和功能的关系密切。糖基化调控蛋白质在组织和细胞中的定位、功能和活性[27],糖基化位点发生变化可能与疾病的发生有关[28],在DQ基因 α 链上,第 82 和 121 位的氨基酸是2个糖基化位点[29],其中第 82 位氨基酸位置对应于 exon 2 区域 4 134～4 145 bp 的核苷酸,即为糖基化修饰区域。蛋白质的糖基化修饰能够影响多肽的构象,使多肽链具有一定刚性,达到增强蛋白质稳定性的作用。因此,SLA-DQA基因潜在的糖基化位点有可能与某些疾病密切相关。

SLA多态性的差异与猪对疾病抵抗能力的强弱有关。通过开展烟台黑猪SLA-DQA 基因多态性研究,建立和探讨了 CDS 区蛋白质的二级、三级结构模拟图,并对蛋白质的功能和作用有了更进一步的了解,本研究结果为更好地了解 MHC 复合体及其在猪的抗病育种中的应用提供了重要的理论依据。

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Polymorphism and Bioinformatics Analysis ofSLA-DQAGene CDs in Yantai Black Pig

HUANG Xiaoyu1,YUAN Junhu2,YANG Qiaoli1,MA Yanping1，GUN Shuangbao1,3

(1.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Henan Luohe Animal Husbandry Bureau,Luohe 462000,China;3.Gansu Research Center for Swine Production Engineering and Technology,Lanzhou 730070,China)

The PCR-SSCP,cloning sequencing and bioinformatics methods were used to explore the Yantai black pigSLA-DQAgene coding polymorphisms,structural prediction and functional characteristics of the protein.The results showed thatSLA-DQAgene exon 2,exon 3 and 4 were detected 4,6,4 alleles and 5,8,7 genotypes,respectively,and three new alleles were found for the first time.TheSLA-DQAcoding region encoded 255 amino acids,32 nucleotide mutations and 13 amino acid mutations were found,and exon 2 showed the most polymorphism.Protein prediction results showed that random coil and extended chain accounted for the highest level,alpha helix distribution concentrated,beta sheet appeared the least.The putative result ofSLA-DQAgene protein function showed that the odds of energy metabolism,structural protein and growth factor were higher.These results could provide the theory foundation for the application ofSLA-DQAgene to pig disease resistance molecular breeding.

Yantai black pig;SLA-DQAgene;Coding region;Polymorphism;Protein structure

2016-06-18

DQA和DRA基因与仔猪腹泻死亡的分子标记技术项目(GNSW-2008-04);高繁殖力猪新品系选育研究项目(092NKDA036);甘肃省优质猪肉生产配套技术研究与示范项目(0804NKCA065)

黄晓宇(1989-),女,河南兰考人,在读博士,主要从事动物遗传育种与繁殖研究。

滚双宝(1967-),男,甘肃张掖人,教授,博士,主要从事动物遗传育种与繁殖研究。

S828;Q78

A

1000-7091(2016)05-0086-08

10.7668/hbnxb.2016.05.013