棉花转录因子GhSNAC3启动子的克隆与表达分析

马骏骏,柳展基,李 菲,王立国,傅明川,朱新霞,刘任重

(1.山东棉花研究中心,山东 济南 250100;2.石河子大学 生命科学学院,农业生物技术重点实验室,新疆 石河子 832003)



棉花转录因子GhSNAC3启动子的克隆与表达分析

马骏骏1,2,柳展基1,李 菲1,王立国1,傅明川1,朱新霞2,刘任重1

(1.山东棉花研究中心,山东 济南 250100;2.石河子大学 生命科学学院,农业生物技术重点实验室,新疆 石河子 832003)

为研究棉花NAC转录因子基因GhSNAC3启动子的结构和功能,以鲁棉研32号基因组为模板,用PCR扩增的方法得到棉花基因GhSNAC3的启动子序列,利用分析网站Plant CARE、PLACER和BDGP对启动子上存在的顺式作用元件进行了预测与分析,在此基础上利用该启动子及GhSNAC3基因构建植物表达载体,并通过烟草遗传转化进一步研究启动子的转录活性。结果表明GhSNAC3启动子除含有CAAT-box等基本顺式作用元件外,还含有茉莉酸、赤霉素和脱落酸响应元件以及大量光顺式作用元件和逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件。采用不同胁迫处理转基因烟草并进行表达分析,结果显示GhSNAC3在盐胁迫下植株根部有高水平的表达,而在茎和叶中表达量极低,表明GhSNAC3在逆境胁迫应答过程中可能具有重要功能,其启动子是一个盐诱导型启动子,具有组织特异性。研究结果为棉花NAC信号通路研究和耐盐基因工程改良提供了理论依据。

棉花;NAC;启动子;盐诱导

棉花是世界范围内重要的经济作物,我国是棉花的重要贸易国,棉花与人们的生产生活息息相关，在我国国民经济中占有重要的地位,但是随着近年来环境问题的日益严重,我国棉区正向盐碱、干旱、贫瘠的土地转移。因此利用有限的土地资源和环境条件,提高棉花抗性、产量和品质,是棉花研究的重要方向。近年来，随着棉花基因组研究取得重大突破,二倍体雷蒙德氏棉和亚洲棉、四倍体陆地棉和海岛棉的基因组相继被破译,这对于探究棉花基因、启动子功能和调控网络具有重大的推进作用。NAC转录因子是一类植物特有的转录调控因子。Aida等[1]发现在矮牵牛NAM(Noapicalmeristem) 基因、拟南芥ATAF1/2基因和CUC2 (Cup-shapedcotyledon) 基因编码蛋白的N末端有一段高度保守序列,取3个基因的首字母,命名为NAC。NAC蛋白N末端为NAC结构域,由大约150个保守的氨基酸组成,包括A～E5个亚结构域。NAC蛋白C末端则高度多样性,行使转录激活功能[2]。随着NAC转录因子研究的深入,发现它在植物的生长发育、叶片衰老、调节激素响应和抵抗胁迫等方面发挥重要的作用[3-11]。

启动子作为基因的组成部分,是与RNA聚合酶特异性识别和结合的序列。它对转录起始有调节和控制的作用,决定着基因表达的时间、空间与状态。在许多转录因子基因的启动子区域中存在许多与逆境和激素相关的顺式作用元件,因此启动子的研究是表达调控研究的前提和基础。对高效表达启动子的分离及功能分析也是植物基因工程一个重要的研究方向。除此之外,启动子分析对于构建基因工程载体,表达目的蛋白也有着重要的意义。对于NAC转录因子的研究还主要集中在基因的发掘和表达分析上,而对它们启动子的了解并不十分深入,但目前对NAC启动子的相关研究也取得了令人可喜的成果。大豆中的NAC转录因子GmST1和GmST2的表达受盐、旱等非生物胁迫诱导,对GmST1和GmST2启动子转基因拟南芥进行了GUS染色分析,其表达无组织特异性,但盐和ABA可以诱导使表达上调[12]。水稻基因OsNAC5和OsNAC6的启动子片段转拟南芥原生质体发现ABA可诱导启动子的启动[13]。拟南芥中的NAC1基因是生长素信号介导促进侧根发生的重要转录因子,其表达强度与生长素浓度、侧根原基发生强度呈正相关;经构建的GFP植物表达载体发现NAC1基因的启动子受生长素和赤霉素诱导启动,说明NAC1是生长素反应基因[14]。在研究中发现，拟南芥中的JUB1基因具有调节H2O2的功能,在过表达转基因植物中是通过调节活性氧以提高非生物胁迫抗性的,其启动子中含有DREB2A,在非生物胁迫中具有重要的调节作用[15]。

研究棉花基因及启动子的功能,为育种和生物工程提供新的思路,从陆地棉优良品种鲁棉研32号中克隆并鉴定了一个NAC转录因子，命名为GhSNAC3,经研究发现GhSNAC3受高盐、黄萎病和干旱胁迫的诱导表达,参与并响应多种逆境胁迫。本研究就GhSNAC3基因的启动子序列进行克隆,分析启动子序列中含有的顺式作用元件,构建该启动子及基因的植物表达载体,并转烟草模拟盐和干旱胁迫。发现在胁迫处理后,在GhSNAC3启动子的启动下GhSNAC3基因相对表达量升高。

1 材料和方法

1.1 试验材料

鲁棉研32号由1565系(石368×澳A93-14组合后代选系)与鲁棉研18号杂交后经系统选育而成,于2008年通过山东省审定。经山东省区试鉴定,该品种表现为抗枯萎病、耐黄萎病、高抗棉铃虫。

1.2GhSNAC3基因启动子的克隆

将GhSNAC3测序结果在雷蒙德氏棉花基因组数据库上比对,发现GhSNAC3在12号染色体上。根据此序列在线设计引物扩增基因的启动子序列(http://www.idtdna.com/primerquest/Home/Inde)。引物序列为GhSNAC3-PF(AACCCTAGGTTCAAAC CGCAT),GhSNAC3-PR(CTCAGCAATGATGGGCA CAGA)。

1.3GhSNAC3启动子序列分析

运用在线软件(https://sogo.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/sogo.cgi?lang=en)、Plant CARE、PLACER和BDGP等分析启动子区域可能存在的基本启动子元件和顺式作用元件。

1.4 植物表达载体pPGhSNAC3的构建

根据GhSNAC3启动子及基因序列和植物表达载体pCAMBIA3301的多克隆位点,在目的片段两端分别设计带有Hind Ⅲ和NcoⅠ的酶切位点引物:GhHindⅢ(ACCAAGCTTGAACACAAAGAAGGCAAA CTTACAGC)和GhNcoⅠ(AACCCATGGGATCCAATT GTTTGTCACCCACC)。下划线表示酶切位点。将带有酶切位点的目的基因转入T载体大肠杆菌感受态中备用。用Hind Ⅲ和NcoⅠ双酶切载体pCAMBIA3301和T载体-ProGhSNAC3+GhSNAC3,分别回收pCAMBIA3301的载体片段和T载体-ProGhSNAC3+GhSNAC3上的目的基因片段,纯化酶切目的片段和载体片段后进行连接反应,连接产物转化大肠杆菌。经菌液PCR和测序鉴定后得到重组质粒pPGhSNAC3。用热击转化法将pPGhSNAC3质粒转入农杆菌菌株GV3101中。

1.5 pPGhSNAC3烟草遗传转化

采用叶盘法转化烟草叶片。待愈伤组织长出丛生芽及丛生根时,用试剂盒Plant Genomic DNA Kit提取幼苗的叶片DNA。采用目的基因序列特异引物GhHind Ⅲ和GhNcoⅠ,PCR验证获得阳性植株。扩增程序:94 ℃,4 min;94 ℃,30 s，60 ℃,55 s，72 ℃,90 s,35个循环;72 ℃,7 min。由于载体上带有除草剂筛选基因bar,所以将经PCR验证的T1转基因株系用浓度为3‰的除草剂进一步筛选,根据T2株系的分离情况获得纯合转基因烟草株系。

1.6GhSNAC3基因表达分析

将经过验证的纯合体烟草植株移栽到大盆中,温室常规管理,待成熟后收种子保存备用。将烟草种子在MS培养基上发芽7 d后,将幼苗分别移植到含200 mmol/L NaCl的盐胁迫MS培养基及含200 mmol/L甘露醇的干旱胁迫MS培养基上。胁迫处理后的样品分别在0,1,2,6,12,24 h时,取根洗净后迅速放于液氮中速冻,存放在-80 ℃冰箱中保存备用。采用 TaKaRa公司生产的试剂盒(SYBRRPremix ExTaqTMⅡ)检测GhSNAC3相对表达量。根据GhSNAC3及其启动子片段的非保守序列设计了荧光定量PCR引物qGhSNAC3F(GCAATGGTGAC AGTTGCTCCAT)和qGhSNAC3R(AACACAAAGAAG GCAAACTTACAGC)。棉花内参基因用ubiquitn(GenBank:EU604080.1),其引物序列为GhubF(AAGACCTACACCAAGCCCAAGA)和GhubR(CTC TTTCCTCAGCCTCTGAACCT)。反应体系为:正向引物,0.8 μL;反向引物,0.8 μL;50×ROX Reference DyeⅡ,0.4 μL;cDNA,1 μL;2×SYBRR Premix Ex TaqTMII,10 μL;ddH2O,7 μL。qPCR扩增程序:95 ℃,10 min预变性;95 ℃,10 s,60 ℃,30 s,72 ℃,20 s,40个循环;68 ℃,5 min。

2 结果与分析

2.1GhSNAC3启动子序列克隆

采用PCR方法从棉花叶片基因组 DNA 中扩增GhSNAC3的启动子,大小为1 279 bp(图1),测序结果表明,获得的GhSNAC3启动子序列与网站中的序列完全一致(图2) 。

2.2GhSNAC3启动子序列分析

为了预测GhSNAC3启动子序列内的顺式作用元件,扩增了1 279 bp含有部分启动子的序列,分析其中可能存在的元件,如图2、表1所示。

M.分子量标准DL2000;1.PCR 产物。

经过分析发现所克隆序列中的元件大致分为2种。1种为少量重复或单拷贝元件。如与逆境胁迫相关的元件:OSE2ROOTNODULE(CTCTT,3拷贝),与病原菌诱导相关的元件[16];GT1GMSCAM4(GAAAAA,4拷贝),盐诱导响应相关元件[17];W-box(ACTGG,单拷贝),参与植物胁迫应答响应元件[13,18];DPBFCOREDCDC3(ACACNNG,单拷贝),脱落酸和干旱响应元件[19];WBOXNTERF3(TGACY,2拷贝),伤害应答元件,抵御伤害[20];MYBCORE(CNGTTR,3拷贝),受干旱 及 ABA 诱导表达,调控表皮细胞以及植物多方面的发育[21-22];CBFHV(RYCGAC,2拷贝),脱水响应元件结合位点,参与干旱胁迫应答反应[23];如部分激素响应元件:CGTCA-motif(CGTCA,单拷贝),茉莉酸甲酯响应元件,诱导植物的化学防御[24];GAREAT(TAACAAR,2拷贝),赤霉素响应元件,刺激叶和芽的生长,对植物生长发育有着一定的作用[25]。另1种为多重重复元件。这些元件多位于基因的监管区域,有些在种子、胚胎中优先表达。如TAAAG-motif(TAAAG,6拷贝),调控保卫细胞特异基因表达元件[26];CAAT-box(CAAT,15拷贝),是启动子和增强子区域的保守顺式作用元件[27]。除此之外,还有一些元件在根和叶中表达,如ROOTMOTIFTAPOX1(ATATT,7拷贝),根特异性表达元件[28];CACTFTPPCA1(TACT,14拷贝),叶肉组织特异表达启动元件[29];E-box(CANNTG,5拷贝),种子特异性表达元件、MYC类蛋白的结合位点、调控植物多方面的发育[30];TATABOX5(TATTT,13拷贝),叶绿体谷氨酰胺合成酶基因调节元件[31]。另外,有一些元件与激素调节或逆境响应有关。WRKY71OS(TGAC,13拷贝),赤霉素响应元件、抑制基因表达的负调控元件[32];ACGTATERD1(AGCT,9拷贝),干旱响应元件[33];DOFCORE(AAAG,22拷贝),结合Dof蛋白所需的核心位点,Dof蛋白的表达具有组织特异性,Dof类转录因子在植物中发挥着多种功能,如在抵御胁迫、影响光周期和激素调节等[26，34]。W-box(TGAC,13拷贝),是WRKY蛋白的识别位点、介导ABA、GA或糖代谢反应[18，35]。

图中下划线表示顺式作用元件,下方为元件名称;双下划线表示翻译起始位点;粗体大写字母“A”代表转录起始位点,记为+1。

顺式作用元件Cis-actingelement序列Sequence位置Position生物学功能Function参考文献ReferenceOSE2ROOTNODULECTCTT+42(-),-82(+),+187(+)病原菌诱导相关元件[16]GT1GMSCAM4GAAAAA-353(-),+7(+),+119(+),-815(+)盐诱导响应相关元件[17]DPBFCOREDCDC3ACAC-NNG-267(-)脱落酸和干旱响应元件、bZIP转录因子结合位点调控胚胎发育基因的表达[19]CGTCA-motifCGTCA-73(-)茉莉酸甲酯响应元件[24]EECCRCAH1GANTT-NG+207(-)MYB转录因子LCR1的结合位点[22]G-boxCAGCTC+135(-),-276(+)光响应元件[36]WBOXNTERF3TGACY-849(-),+247(+)伤害应答元件[20]MYBCORECNGTTR-322(-),-953(-),-928(+)受干旱及ABA诱导表达,调控表皮细胞以及植物多方面的发育[22]

表1(续)

2.3 植物表达载体pPGhSNAC3的构建及转化

为研究棉花GhSNAC3基因及其启动子的表达模式,构建了pPGhSNAC3植物表达载体(图3),经双酶切检验(图4)并转化到模式植物烟草中进行验证。分离转基因烟草基因组DNA,经 PCR验证后确认获得了含有GhSNAC3 基因及启动子的转基因烟草植株(图5)。

2.4 转基因植株中GhSNAC3表达的组织差异性分析

分别提取阳性转基因烟草的根、茎和叶的总RNA,总RNA明亮清晰,反转出cDNA并进行半定量PCR,所用内参为棉花内源基因Actin(AY305737)。结果显示由 ProGhSNAC3 所驱动的GhSNAC3基因在烟草的根部表达量最高,在茎和叶中微量表达。这说明ProGhSNAC3的表达具有组织特异性,在根组织中特异性表达(图6)。

图3 pPGhSNAC3载体构建流程图

M.1 kb Marker;1.双酶切pPGhSNAC3;2.质粒pPGhSNAC3。

M.DL2000 Marker;1.独立转基因株系。

2.5 胁迫条件下GhSNAC3基因的相对表达量

转基因烟草经200 mmol/L NaCl盐胁迫及200 mmol/L甘露醇干旱诱导胁迫处理后,取根做实时荧光定量PCR分析。结果显示2种胁迫处理后GhSNAC3的相对表达量均明显增加(图7)。在200 mmol/L NaCl处理条件下,1 h时相对表达量与对照0时刻相差不多,在2 h时基因相对表达量有所升高,在6 h时基因的相对表达量达到最高大约为0时刻的7倍。12,24 h时基因相对表达量呈下降趋势但仍比对照高5倍以上;在200 mmol/L甘露醇的处理条件下,胁迫处理1 h时基因相对表达量升高不明显,2,6 h时大约为对照的4倍,12 h时基因相对表达量为对照的5倍,24 h时基因相对表达量呈下降趋势但仍为对照的3倍左右。

1.根;2.茎;3.叶。

图7 干旱和盐胁迫诱导后GhSNAC3表达情况

3 讨论

NAC转录因子作为植物特有的反式作用因子,可以特异的与顺式作用元件相互结合,以调节基因的表达。而启动子则是基因的一部分,它包含RNA聚合酶识别位点,可以控制基因表达(转录)的起始时间和表达的程度。启动子就像“开关”一样,决定了基因的活动。因此，在研究转录因子过程中,发掘启动子部分的顺式作用元件对于更透彻的研究基因具有重要的意义。

以35S启动子构建植物过表达载体研究发现GhSNAC3受高盐、黄萎病和干旱胁迫的诱导表达,参与相应的逆境胁迫。克隆分析GhSNAC3启动子,发现启动子里含有多个与逆境胁迫响应(如DPBFCOREDCDC3、MYBCORE和WBOXNTERF3等)、激素调节(如MYCCONSENSUSAT、WRKY71OS和W-box等)和光诱导相关的元件(如G-box、Box4和I-box等)[48]。前人研究认为在顺式作用元件中G-box是常见的受光调节的元件,并且能够调节基因在光诱导条件下的转录活性[36,43]。此外,还有研究证实E-box元件是存在于多个与种子贮藏蛋白相关的启动子上的保守序列[39-40]。拟南芥的NAC转录因子ANAC072基因,其表达受干旱、ABA、茉莉酸(JA)和高盐诱导,而在基因启动子区域中 包含有MYC、W-box和MYB 等与逆境胁迫密切相关的重要调节元件[13]。巴西橡胶树HbNAC1 基因启动子中含有茉莉酸响应元件、MYBCORE和W-box等多种与非生物胁迫应答相关的元件,这表明HbNAC1 基因在橡胶树逆境胁迫应答过程具有重要功能[49]。还有研究表明MYB和MYC的识别位点在ABA 信号通路和非生物胁迫应答中具有重要作用[50]。

在GhSNAC3启动子及基因相对表达的研究中也证实GhSNAC3基因在盐和干旱胁迫处理下相对表达量均有所提高,说明GhSNAC3基因与逆境胁迫相关,受逆境诱导表达,并且表达具有组织特异性。所以初步判断GhSNAC3的启动子属逆境胁迫诱导基因,也属于诱导型启动子,并且参与逆境胁迫响应;在植物逆境响应中发挥一定的调控作用,具有重要的利用价值,该启动子可用于研究在逆境胁迫中基因的功能。我们将通过基因工程技术验证该基因在棉花非生物逆境应答中的功能,并试图进一步揭示其调控的分子机制。

致谢：本研究所用黄萎病菌系由江苏省农业科学院植物保护研究所和经济作物研究所提供,特此致谢。

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The Cloning and Expression Analysis of Transcription FactorGhSNAC3 Promoter in Cotton

MA Junjun1,2,LIU Zhanji1,LI Fei1,WANG Liguo1,FU Mingchuan1,ZHU Xinxia2,LIU Renzhong1

(1.Shandong Cotton Research Center,Jinan 250100,China;2.College of Life Sciences,Shihezi University,Key Laboratory of Agrobiotechnology,Shihezi 832003,China)

In order to analyze the structure and function of the promoter of cotton NAC transcription factor geneGhSNAC3,the promoter fragment was cloned and identified from Lumianyan 32 inGossypiumhirsutumL..The cis-acting elements in the promoter sequence was predicted and analyzed by using the online database of Plant CARE,PLACER and BDGP.A plant expression vector consisting ofGhSNAC3 and its promoter was constructed and transformed intoNicotianatabacumL.to investigate the transcription activities of the promoter under different stress treatments.The results showed that besides the basic cis-acting elements such as CAAT-box,there existed several MeJA,GA and ABA-responsive elements as well as multiple light-responsive elements and stress-induced controlling elements in the promoter.Under salt stressGhSNAC3 had a high level of expression in the roots of transgenic tobacco plants,while the expression level was low in the stems and leaves,suggesting that the geneGhSNAC3 might played an important role in stress responses in cotton,and its promoter might be tissue-specific and salt-inducible.The results provide the basis for the further study of cotton NAC signal pathway as well as salt tolerance improvement through genetic engineering in the future.

Cotton;NAC;Promoter;Salt-induced

2016-07-10

国家自然基金项目(31571755);山东省优秀中青年科学家科研奖励基金计划项目(BS2015NY014);山东省农业科学院青年基金项目(2914QNM28)

马骏骏(1989-),女,黑龙江桦南人,在读硕士,主要从事植物逆境分子生物学研究。

朱新霞(1968-),女,新疆石河子人,副教授,博士,主要从事植物生物技术和分子育种研究。

刘任重(1965-),男,山东诸城人,研究员,博士,主要从事棉花转基因育种研究。

Q78;S562.03

A

1000-7091(2016)05-0035-09

10.7668/hbnxb.2016.05.006