毛细管电泳技术在氨基酸分离教学实验中的应用

李　华, 孙书洪, 亓树艳, 孔令洪, 陈　波, 龙建纲, 孔　宇

(1. 西安交通大学 生物科学与技术学院, 陕西 西安　710049；2. 西安交通大学 南洋书院, 陕西 西安　710049)



毛细管电泳技术在氨基酸分离教学实验中的应用

李华1, 孙书洪1, 亓树艳1, 孔令洪1, 陈波2, 龙建纲1, 孔宇1

(1. 西安交通大学 生物科学与技术学院, 陕西 西安710049；2. 西安交通大学 南洋书院, 陕西 西安710049)

在本科生物化学实验课程中,原氨基酸分离实验采用传统的纸层析法分离,该方法存在耗时长、试剂毒性大、准确性差、斑点不清晰等缺点。针对传统纸层析法的不足,应用毛细管电泳对氨基酸进行分离,并对影响分离效果的条件进行了优化。改进后的实验课程,在更安全有效分离氨基酸的基础上,极大地提高了学生实验的主动性和积极性。

毛细管电泳； 氨基酸； 生物化学实验

在生物类专业本科的基础课程“生物化学实验”教学环节中引入交叉学科的新技术、新手段有利于学生及时了解、掌握学科的前沿,提高学生的学习兴趣和实验技能,并为后续的专业理论和实践课程的开设打下良好的基础[1-2]。

我校生命科学与技术学院开设的“生物化学实验”是针对本校生物工程专业、生命科学基础人才培养基地等专业学生开设的主干实验课程,为专业基础实验课。实验中根据生物理论课程的安排,对应地将实验课程安排为糖类、脂肪、核酸、氨基酸、蛋白质、酶、酮体和维生素8个实验模块,共10个实验。

在氨基酸实验中,为配合学生在理论课程中学习的氨基酸性质相关知识点,开设了混合氨基酸的分离检测这一实验内容。在原先的教学计划中采用传统的纸层析分离,该分离方法存在耗时长、试剂毒性大(正丁醇、氨水等)、层析斑点有时存在不清晰或拖尾等缺点[3-5]。同时,学生在实验过程中也反映,大量使用有机挥发类试剂让有些学生出现头晕、胸闷等不适症状,而且有的学生在高中实验中做过纸层析色谱的类似实验，因此设计了一种简单、快速、试剂毒性低、准确性高的检测方法[6-7]。

1　实验部分

毛细管电泳(CE)是近些年发展迅速的一项微分离技术,具有高效、快速、灵敏、待测样品用量少等优点，因此,CE被广泛地用于多个领域,例如,临床医学、手性物质分离、生物制药、蛋白质分析等领域。实验利用毛细管电泳仪-紫外检测联用手段,以常见的4种氨基酸[组氨酸(His),精氨酸(Arg),半胱氨酸(Cys),色氨酸(Trp)]为分离物,建立快速、准确分离分析氨基酸的仪器分析方法,使学生在快速分离氨基酸的过程中,学习和掌握毛细管电泳仪的工作原理和操作方法,拓展学生的思路[8-9]。

1.1仪器装置与试剂

毛细管电泳仪系统:Beckman-MDQ毛细管电泳系统(Beckman,Fullerton,CA,USA,带紫外检测器、自动进样器和温度控制器,仪器控制和数据分析软件为Beckman 32 Karat 8.0)、熔硅毛细管(河北永年光纤厂)、pH计(MettlerTolrdo,PE30,USA)、离心机(Eppendorf AG,Eppendorf 5417R,Hamburg,Germany)、超纯水仪(Millipore,Mili-Q,New Bedford,MA,USA)。

试剂：组氨酸、精氨酸、半胱氨酸、色氨酸(阿拉丁,中国)；磷酸一氢钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、盐酸(中国医药集团总公司化学试剂有限公司)。

1.2溶液的配制

(1) 1.0 mmol/L组氨酸标准溶液的配置:精确称取1.5 mg于15 mL离心管中,用移液器向离心管中加入10.0 mL 蒸馏水,涡旋混匀仪充分混匀,放入4 ℃保存,备用。

(2) 4.0 mmol/L精氨酸、4.0 mmol/L半胱氨酸、1.0 mmol/L色氨酸的标准溶液配制方法同上。

(3) 混合标准溶液的配制:将分别配制的1.0 mmol/L组氨酸、4.0 mmol/L精氨酸、4.0 mmol/L半胱氨酸各吸取500 μL和1.0 mmol/L,色氨酸标准溶液吸取250μL,加入2.0 mL试管中,涡旋混匀仪充分混匀,放入4.0 ℃保存,备用。

(4) 1.0 mol/L氢氧化钠溶液的配制:精确称取4.0 g 氢氧化钠,溶解于50 mL烧杯中,转移至100 mL容量瓶,定容。

(5) 磷酸缓冲溶液配制:根据配制磷酸缓冲液的浓度分别计算二水合磷酸二氢钠和十二水合磷酸氢二钠的用量,并分别用50 mL烧杯溶解,再用100 mL容量瓶定容。再利用公式(1),计算2种溶液混合比例,使配置的磷酸缓冲溶液pH分别为5.0、6.0、7.0和8.0。

(1)

式中:pH,缓冲溶液pH；pKa,磷酸解离常数的负对数；Cb,磷酸二氢钠在溶液中的浓度(mmol/L)；Ca,磷酸氢二钠在溶液中的浓度(mol/L)。

1.3毛细管处理

(1) 截取一段已知长度的毛细管(48 cm×75 μm I.D,有效长度37 cm),在相应位置烧制长度1 mm左右的检测窗口,小心装入毛细管卡套中,固定好检测窗口。首次使用的毛细管,用1.0 mol/L的氢氧化钠冲洗10 min并放置过夜。隔天,用双蒸水和电泳缓冲溶液各冲洗10 min(冲洗压力20 p.s.i)。

(2) 在每2次运行之间分别用水、1.0 mmol/L氢氧化钠、水、缓冲液各冲洗5 min,以保证峰型和保留时间具有良好的重现性。为了保证学生在实验进行过程中有良好的操作性和简便性,并且更加深入地了解毛细管电泳的工作原理,实验中,选了经典的毛细管电泳分离模式——毛细管区带电泳对4种不同的氨基酸进行分离。

2　实验结果与讨论

传统利用纸层析分离氨基酸的方法中,实验结果不太理想,主要包括氨基酸层析斑点不清晰(甚至没有层析斑点出现)、色斑拖尾现象严重、实验时间长。针对这些情况,采用毛细管电泳方法对4种氨基酸的分离进行了探索[10]。

2.1缓冲溶液pH对分离效果的影响

电泳缓冲溶液pH值是影响分离的一个重要因素,它通过影响电渗流、分析物质的带电情况,最终影响分离度和分离效果。实验中选用最常用的磷酸盐缓冲溶液对pH值进行系统优化,考虑到磷酸盐缓冲液的最大缓冲能力在7.2附近,因此分别研究了pH为5.0、6.0、7.0和8.0时,4种氨基酸之间的分离度(resolution,Rs),并以Rs值为pH优化的标准，见表1。

表1　不同pH条件下的Rs值

注:当pH值为5和6时,半胱氨酸和色氨酸峰型完全重合,因此无法计算半胱氨酸和色氨酸、组氨酸和色氨酸的Rs值。

从表1中可以得出:pH值在为5.0、6.0时,总有2种或3种不同的氨基酸无法得到分离。在pH值为7.0时,可以看到4种氨基酸都能够得到较好的分离(Rs值均大于1.5,见图1),而在pH值为8.0时,主要是组氨酸和色氨酸的分离度Rs小于1.5(Rs=1.28)。但从Rs值的角度可以看到,改变一些实验条件,例如继续提高pH值或是增加毛细管长度等,也能够将4种氨基酸进行分离。这些实验现象的分析能够很好地培养学生的科学思维能力,体会完成一个实验的方法并不是一成不变,进而让学生的思维更加活跃。

图1　4种混合氨基酸在pH 7条件下的电泳分离图

在后续的实验中,选择pH值为7.0的磷酸盐缓冲液作为电泳缓冲液进行其他实验条件的优化。

2.2缓冲溶液浓度对分离效果的影响

电泳缓冲液浓度与双电层厚度、电渗流大小、焦耳热产生量及缓冲液黏度等因素有着密切的关系。因此本次实验中对缓冲液浓度(20.0～ 60.0 mmol/L)进行了优化。当缓冲溶液浓度较高时,缓冲溶液电阻较小,双电层厚度较薄,电渗流较小,从而使分离的氨基酸在毛细管中的停留时间较长,有利于分离。当缓冲溶液浓度小于40.0 mmol/L时,4种氨基酸分离度较差(Rs<1.5)。然而当溶液浓度达到60.0 mmol/L时,4种氨基酸之间的Rs值会增加,但当分离电压20.0 kV时,整个体系中的电流达到120.4 μA,电流较高会损伤仪器,缩短仪器寿命。考虑到以上的因素,最终选择了40.0 mmol/L为缓冲液的浓度。

2.3分离电压和温度对分离效果的影响

实验中还探索了分离电压和温度对氨基酸分离效果的影响,发现在低电压情况下(15.0 kV)氨基酸迁移速度比较慢,色谱峰展宽比较严重,影响分离效果。因此,在电泳缓冲液浓度选择为40.0 mmol/L的条件下,尽量提升分离电压,分离电压为20.0 kV的时候,4种氨基酸能够得到较好的分离效果,同时,系统中的电流为68.5 μA,分离时间小于6 min。

实验中将毛细管的温度设定为20 ℃或25 ℃,发现温度的改变对实验结果基本上没有影响。因此,只要在实验中保证毛细管温度在20 ℃左右即可。

综上所述,优化分离4种氨基酸实验条件为:利用非涂层毛细管,有效长度37 cm；电泳缓冲液选取40.0 mmol/L 磷酸盐缓冲液(pH 7.0)；以0.5 p.s.i压力进样0.5 s,分离电压+20.0 kV。实际4种氨基酸的结果分离图,如图1所示。

3　实践与成效

3.1提高学生的实验积极性

利用毛细管电泳仪分离氨基酸,学生不仅能在课堂上亲手操作大型仪器,同时还需要根据提供的氨基酸信息配制相应的缓冲溶液。学生根据实验结果和学习到的相关知识,分析产生结果的原因,提出合理的优化条件,在提出优化条件后,再次进行实验。与原方法相比,毛细管电泳方法极大地增强了课堂上学生的参与度和积极性,提高了对生物化学实验的兴趣。

3.2有利于高层次人才培养

学生在本科阶段课程的学习中会接触到许多大型仪器的知识,如毛细管电泳仪、气象色谱、液相色谱等,但由于条件所限,通常的理论教学内容把重点放在了大型仪器的原理上,纯数学的理论公式或大量的叙述仅让学生从认知体系上了解仪器的特点,无法加深学生对课程所学知识的透彻理解,忽略了基本技能的培训。在新的实验过程中,学生首先需要将学习到的氨基酸基础知识和毛细管的分离原理相结合,选择出一个合适的缓冲溶液pH值,以达到4种不同氨基酸分离的效果,并且预测出4种氨基酸出峰顺序,将预测结果和原因写在随堂实验报告表上。随后结合分析化学的知识,自己计算出2种磷酸盐缓冲溶液的混合比例,配制相应pH值的缓冲溶液。因此,通过利用毛细管电泳分离检测氨基酸,不仅能够使学生更加深入理解氨基酸两性化合物的性质和毛细管电泳仪内部结构、工作原理,而且能够将书本上介绍仪器的基础知识和实际应用很好地结合在一起[11]。

通过在本科阶段让学生简单地操作一些大型分析类仪器,可以打破学生“进口仪器不敢使用”的心理障碍[12]。同时,大型仪器在本科教学中的使用,可以开阔学生的眼界,利于学生使用更多的大型仪器设备[13],例如气、液相色谱,激光共聚焦扫描显微镜等。

4　结语

实验中,系统优化了缓冲溶液的pH值、浓度、分离电压等重要条件,使整个分离实验能够在6 min内完成,实验结果比较满意。在本科实验中利用毛细管电泳的方法代替传统纸层析分离实验方法,不仅提高了分离效率、减少了有毒有害试剂的使用,同时,调动了学生的实验积极性和主动性。与此同时,让学生体会到实验方法的选择是多种多样的,可以根据所学习的理论知识联系实验实际情况,逐渐摸索将方法不断优化,最终得到满意的实验结果。

References)

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Study on separation of amino acids with capillary electrophoresis and its application in teaching experiment

Li Hua1, Sun Shuhong1, Qi Shuyan1, Kong Linghong1, Chen Bo2, Long Jiangang1, Kong Yu1

(1. School of Life Science and Technology,Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710049, China;2. Nanyang College,Xi’an Jiaotong University,Xi’an 710049, China)

In traditional biochemical experiments,amino acids were separated with paper chromatography,which possesses several disadvantages such as time-consuming,poisonous reagents,low sensitivity and so on. In view of the above shortcomings,the capillary zone electrophoresis method was applied for separation of amino acids. Separation conditions were also systematically optimized.The whole separation procedure was more safely and effectively with capillary electrophoresis. In addition,students’ enthusiasm and initiative were also enhanced.

capillary electrophoresis; amino acid; biochemical experiments

10.16791/j.cnki.sjg.2016.09.042

2016-03-14修改日期：2016-05-04

陕西省教改项目“生物工程专业贯通式创新人才培养实验区建设”；西安交通大学教改项目“生物工程综合开放实验课程建设与实践”

李华(1987—),男,山西夏县,硕士,助理工程师,主要研究方向为生物工程专业教学与管理工作

E-mail：huali2014@mail.xjtu.edu.cn

孔宇(1976—),男,陕西南郑,博士,副教授,主要研究方向为生物工程专业教学管理工作和综合开放实验教学工作.

E-mail：yukong@mail.xjtu.edu.cn

G642.423

A

1002-4956(2016)9-0163-03