长链非编码RNA PANDAR在肾癌中的表达分析及临床意义

金 露，李一帆，何 韬，胡 佳，刘家驹，桂耀庭，杨尚琪，毛向明，来永庆

长链非编码RNA PANDAR在肾癌中的表达分析及临床意义

金 露1，2，3，李一帆1，2，3，何 韬2，3，胡 佳2，3，刘家驹2，3，桂耀庭2，3，杨尚琪2，3，毛向明2，3，来永庆2，3

目的 检测长链非编码RNA PANDAR在肾癌及癌旁组织中的表达水平，探讨其在肾癌中的临床意义。方法 提取48对组织（肾癌及对应癌旁组织）中的总RNA，经逆转录获得cDNA后通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qRTPCR）方法检测PANDAR表达量，分析正常组织与肾癌组织中的表达差异，探讨其表达水平与患者临床特征之间的联系。结果 肾癌组织中PANDAR的表达水平明显低于配对癌旁正常组织（P＜0.001），标本中共有38例（79.17%）肾癌标本PANDAR表达下调，癌组织中PANDAR表达与患者TNM分期和AJCC分级相关，与患者年龄、性别及肾癌病理类型无明显相关性（P＞0.05），PANDAR低表达组患者生存率低于高表达组患者（P＜0.05）。结论 PANDAR在肾癌组织中表达明显下调，且和肾癌TNM、AJCC分级和预后相关，提示其有作为肾癌标志物应用于临床的可能。

肾癌；肿瘤分期；长链非编码RNA；PANDAR

肾细胞癌（renal cell carcinoma，RCC）又称肾癌，是泌尿系统常见的恶性肿瘤，约占成人恶性肿瘤的3%［1］。肾癌对放疗和化疗均不敏感，手术切除是主要的治疗方式，但术后复发、转移率极高［2］。目前在临床尚无可用于肾癌早期诊断或治疗的生物标志物，因此有必要对肾癌的发生机制进行深入研究，以期找到相关肾癌标志物。近年来，长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）引起了人们的广泛关注。lncRNA是一类不具有蛋白质编码功能的RNA，长度在200个核苷酸以上，一般低于20 000个核苷酸［3］。基因组学的研究［4］表明，哺乳动物的基因可以转录出大量不具有蛋白编码功能的RNA，有生物活性并在多种疾病中存在异常表达。另外，LncRNA可在转录、转录后水平调控基因表达［5］。该研究选择lncRNA PANDAR（promoter of CDKN1A antisense DNA damage activated RNA）作为研究对象，探讨其在肾癌中的临床意义。

1 材料与方法

1.1 组织标本 选取安徽医科大学第一附属医院和北京大学深圳医院手术切除的48对肾癌组织及配对癌旁组织，标本均得到医院医学伦理委员会批准且患者已签署知情同意书。每对标本包括肾癌组织及癌旁正常组织（取自根治性肾切除术距肾癌组织＞2 cm的肾组织）各1份，病理切片证实肾癌组织含癌组织80%以上，癌旁组织中无癌组织侵犯。标本切除后保存于-80℃冰箱中备用。患者临床资料完整（表1），术后均进行了常规随访。肾癌临床分期参考国际抗癌组织（UICC）/美国癌症联合会（AJCC）2010年肾癌分期。

1.2 RNA提取 在液氮下碾磨标本组织，加入TRIzol试剂（美国Invitrogen公司），说明书所述提取肾癌标本组织中的总RNA，使用ND-2000/2000c紫外分光光度计测定其浓度，提取后的总RNA保存于-80℃冰箱。

1.3 逆转录 根据RNA反转录试剂PrimeScriptTMRT reagent Kit（日本TaKaRa公司）说明书所述，取1 μg总RNA，加入反应试剂，使用普通PCR仪完成逆转录。反应条件：42℃ 15 min，之后85℃ 5 s。产物稀释10倍后保存于-80℃。

1.4 实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测PANDAR表达量 根据荧光定量PCR试剂SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ（日本TaKaRa公司）说明书所述，以合成的cDNA为模板，加入反应试剂进行qPCR反应。反应体系包括：模板cDNA 1 μl，2* SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ10 μl，PANDAR正向引物1 μl，PANDAR反向引物1 μl，加无菌蒸馏水至总反应体积20 μl。PANDAR F：5'-CAATGCCTTGCTTCACAGTC-3'，R：5'-TGGGGTTCTTAGAAGTGGTGA-3'；内参选用GAPDH基因，GAPDH F：5'-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3'， R： 5'-GAAGATGGTGGGATTTC-3'。qPCR反应条件：95℃ 2 min预变性；之后95℃ 5 s，60℃30 s，然后70℃ 30 s，共计完成45个循环。

1.5 统计学处理 PANDAR相对表达量采用ΔΔCt法分析，以GAPDH为内参进行标准化处理：ΔCt= CtPANDAR-CtGAPDH，ΔΔCt=ΔCtRCC-ΔCtNormal。通过2-ΔΔCt计算PANDAR在肾癌组织与癌旁正常组织表达量比值，使用SPSS 17.0完成统计分析。采用配对t检验分析配对组织间PANDAR表达量的差异；将患者按PANDAR表达水平及临床特征分组列出四格表，采用χ2检验分析；采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验比较两组患者生存率差异；P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PANDAR在肾癌组织中表达下调 48对肾癌组织中共有38例肾癌标本表达量低于配对癌旁组织，肾癌组织与配对癌旁组织中PANDAR表达量比值经对数转换后如图1所示，纵坐标为 log2Ratio （T/N），横坐标以下表示肾癌组织表达量低于配对癌旁组织；肾癌组织中PANDAR表达量明显低于癌旁正常组织（t=-4.016，P＜0.001），癌旁正常组织中PANDAR表达量是肾癌组织的2.42±0.25倍。

2.2 PANDAR的表达水平和患者临床分期、分级相关 以肾癌组织中PANDAR的-ΔΔCT平均值-1.27为界将患者分为高表达组、低表达组，其中低表达组26例；根据患者年龄中位数将患者分为高龄组、低龄组。列出四格表，行 χ2检验，结果显示PANDAR表达水平和患者年龄、性别以及肾癌组织类型无关，在TNM分期和AJCC分级较高的患者PANDAR表达水平更低（P＜0.05）。见表1。

图1 标本组织中PANDAR的表达

图2 PANDAR低表达组和高表达组患者生存率比较

2.3 PANDAR低表达的患者预后较差 纳入研究的患者均进行了常规随访，随访期内死亡18例（37.5%）。将患者分为高表达组、低表达组，采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验比较两组患者生存率，生存曲线见图2，PANDAR低表达组患者的中位生存时间为58个月，低表达组5年生存率（42.31%）明显低于高表达组（72.73%）（P＜0.05）。

3 讨论

肾癌是预后较差的一种肿瘤，已经发生转移的肾癌患者五年生存率约为10%［6］，早期诊断对于提高其预后有很大的帮助，因此有必要寻找可用于肾癌早期诊断的生物标志物。虽然截至目前只发现了少数有功能的lncRNA，但综合现有研究可以发现lncRNA和一系列的生物进程相关，如癌基因的激活、X染色体失活、剂量失活效应、基因的转录和翻译、蛋白质的活性调控等［5］。因此，lncRNA在基因调节中发挥着重要作用。

表1 PANDAR表达水平和肾癌临床分期、分级相关

目前关于lncRNA PANDAR在肿瘤中的相关研究较少，只在肝细胞癌、非小细胞肺癌中有相关报道，且lncRNA PANDAR表达水平均和患者预后相关［7-8］。在肾细胞癌中尚无关于lncRNA PANDAR的研究，本研究首次在肾细胞癌组织中利用qPCR检测PANDAR的表达。现有关于PANDAR的研究［7-8］主要在非小细胞肺癌和肝细胞癌。研究［8］显示，在非小细胞肺癌组织中PANDAR表达下调，且表达量和肿瘤分期、肿瘤体积以及患者预后相关。在非小细胞癌细胞中，PANDAR可通过调节Bcl-2的表达影响细胞凋亡。在肝细胞癌中，PANDAR表达上调且表达水平和患者预后、TNM分级相关，且在肝癌细胞中敲除PANDAR可抑制癌细胞的增殖［7］。本研究首次利用qPCR在肾癌及配对癌旁组织中检测了lncRNA PANDAR的表达，发现PANDAR在肾癌组织中表达明显下调。且PANDAR在肾癌中的表达和肾癌TNM分期、AJCC分级相关，PANDAR低表达组患者生存率低于高表达组患者，提示PANDAR与肾癌患者预后相关，在肾癌的发生发展中起着一定的作用，有作为肾癌生物标志物应用于肾癌诊断、判断预后及治疗的可能性。但本研究病例数偏少，其所致偏倚不能排除，下一步的研究目标将是扩大样本量验证PANDAR的表达，并对PANDAR在肾癌组织细胞中的功能、机制进行研究。

目前在肾癌中关于lncRNA的研究较少，已经发现在肾癌细胞中具有功能的lncRNA有GAS5、MEG3、MALAT1、RCCRT1、HOTAIR［9-14］，其中高表达的MALAT1、RCCRT1发挥着促癌基因的作用，低表达的MEG3、GAS5则发挥着抑癌基因的作用。另外，研究［13］表明RCCRT1的表达水平和肿瘤大小、TNM分级以及淋巴结转移数量相关。因此lncRNA的异常表达和肾癌的发生以及进展存在着一定的关系。

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Expression and clinical significance
of long non-coding RNA PANDAR in renal cell carcinoma

Jin Lu1，2，3，Li Yifan1，2，3，He Tao2，3，et al
（1The Second Clinical Medical College，Anhui Medical University，Hefei 230032；
2Dept of Urology，Peking University Shenzhen Hospital，Shenzhen 518036；3Guangdong and
Shenzhen Key Laboratory of Male Reproductive Medicine and Genetics，Shenzhen 518036）

Objective To detect the expression level of long non-coding RNA（lncRNA）PANDAR in paired renal cell carcinoma（RCC）and normal tissues and explore PANDAR's clinical significance in renal cell carcinoma. Methods Total RNA was isolated from 48 paired tissues，and the total RNA was used to get cDNA by performing reverse transcription.Then real time quantitative PCR（RT-qPCR）was performed to detect the expression of PANDAR.Statistical analysis was performed to explore the differences of PANDAR's expression level and the relationships between the expression of PANDAR and clinical characteristics.Results The expression level of lncRNA PANDAR was significantly lower in RCC tissues（P＜0.001）than paired normal tissues and PANDAR was downregulated in 38（79.17%）RCC tissues.The results showed that the expression of PANDAR was associated with the TNM and AJCC stage.However，no relationships were found between the expression of PANDAR and patients'age，sex and pathological types of RCC.Overall survival rate of patients with lower expression of PANDAR was significantly lower than patients with higher expression of PANDAR（P＜0.05）.Conclusion In RCC tissues PANDAR is down-regulated，and the expression of PANDAR is associated with prognosis，TNM and AJCC stage of RCC，which indicates that it may be involved in the tumorigenesis and development of RCC.

renal cell carcinoma；neoplasm staging；lncRNAs；PANDAR

R 737.11

A

1000-1492（2016）09-1342-04

时间：2016-8-1 14：07

http：//www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160801.1407.048.html

2016-05-04接收

国家自然科学基金（编号：81101922）；深圳市科技研发资 金知识创新计划基础研究项目 （编号：JCYJ20150403091443304）；广东省重点医学专科经费

1安徽医科大学第二临床医学院，合肥 2300322北京大学深圳医院泌尿外科，深圳 5180363广东省男性生殖与遗传重点实验室，深圳 518036

金 露，男，硕士研究生； 来永庆，男，副教授，主任医师，硕士生导师，责任作者，E- mail：yqlord@163.com