RP-HPLC法测定防风通圣丸中栀子苷、芍药苷、黄芩苷、大黄素的含量*

杨小军，方博文，丁永辉

1西北民族大学化工学院，甘肃 兰州 730124；2甘肃省食品药品监督管理局

RP-HPLC法测定防风通圣丸中栀子苷、芍药苷、黄芩苷、大黄素的含量*

杨小军1，方博文1，丁永辉2

1西北民族大学化工学院，甘肃 兰州 730124；2甘肃省食品药品监督管理局

目的：建立RP-H PLC同时测定防风通圣丸中栀子苷、芍药苷、黄芩苷和大黄素含量的方法。方法：采用高效液相色谱（RP-H PLC）梯度洗脱，在不同波长下测定含量。色谱柱:Zorbax Eclipse X D B-C18键合硅胶色谱柱（4.6 m m×150 m m，5 μm）；柱温为室温；流动相为乙腈-2%磷酸水溶液，采用梯度洗脱；流速1.0m L/m i n；检测波长分别为240 nm（栀子苷、芍药苷），275 nm（黄芩苷、大黄素）。结果：栀子苷、芍药苷、黄芩苷和大黄素的进样量分别在0.056～0.56 g（r=0.999 7），0.103 5～1.029 7 g（r=0.999 2），0.207 4～3.128g（r=0.999 3），0.04～0.423g（r=0.999 6）范围内线性关系良好，平均加样回收率分别为99.14%，99.65%，99.03%，99.16%；RSD分别为1.08%，1.01%，0.85%，0.86%。结论：该方法简便、快速、灵敏、精密度高、重现性良好、结果准确，可用于同时测定防风通圣丸中栀子苷、芍药苷、黄芩苷和大黄素的含量。

RP-H PLC；防风通圣丸；栀子苷；芍药苷；黄芩苷；大黄素；含量测定

防风通圣丸（水丸)为收载于《中华人民共和国药典》的成方制剂［1］，由防风、荆芥、薄荷、麻黄、大黄、芒硝、栀子、滑石、桔梗、石膏、川芎、当归、白芍、黄芩、连翘、甘草、白术(炒)17味中药材组成。其中芍药苷、黄芩苷、栀子苷及大黄素为处方中主要有效成分。有报道［2-5］采用高效液相色谱法对防风通圣丸(水丸)中黄芩苷和大黄素的含量测定，但同时测定其中栀子苷、芍药苷、黄芩苷和大黄素含量的方法未见文献报道，本研究采用双波长RP-H PLC法对处方中栀子苷、芍药苷、黄芩苷及大黄素的含量进行测定，为提升防风通圣丸质量标准及含量测定的方法提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验仪器与试药 Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；配置真空脱气机(G1322A)；自动进样器(G1329A)；真空二极管阵列检测器(DAD，G1315B)；四元泵(G1311A)，Zorbox Eclipse XDB-C18键合硅胶色谱柱(4.6m m×150m m，5 μm)；Agilent 1200色谱工作站(美国Agilent公司)；AB204-S型电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)；AP001-0671型抽滤机；AS3120型双频数控超声波清洗仪(天津奥特赛斯恩斯仪器有限公司)；DFT-200型万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；甲醇(分析纯，天津市北方天医化学试剂厂)；甲醇(色谱纯天津市光复精细化工研究所，公司)；乙腈(色谱纯，天津市凯信化学工业有限公司)；磷酸(分析纯，烟台市双双化工有限公司)；水为超纯水。栀子苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：749-8801)；芍药苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110736-201333)；黄芩苷对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110715-201316)；大黄素对照品(中国药品生物制品检定所，批号：110756-200110)；防风通圣丸(水丸)(甘肃众友药业制药有限公司，批号：90903、90904、90905，规格6g×10丸)。

1.2 溶液的制备

1.2.1 对照品溶液的制备 取栀子苷对照品、芍药苷对照品、黄芩苷对照品和大黄素对照品，精密称定后，分别置于10 m L容量瓶中，加一定量甲醇(分析纯)，摇匀，置超声仪中超声至全部溶解，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，即得含栀子苷、芍药苷、黄芩苷及大黄素对照品溶液。然后分别精确量取上述各对照品贮备液按体积1∶1混合，充分摇匀，即得含栀子苷56μg/m L，芍药苷100μg/m L，黄芩苷106 μg/m L，大黄素49 μg/m L的对照品混合溶液，取适量混合对照品溶液，用微孔滤膜(孔径∶0.45μm)滤过，弃去初滤液，取续滤液，备用。

1.2.2 样品溶液的制备 取防风通圣丸约3 g，剪成小块，精密称定，置研钵中，以40 m L甲醇分次研磨，定量转移至50 m L具塞容量瓶中，超声提取1小时，取出放冷至室温后加甲醇定容至刻度，摇匀，静置，取上清液，用微孔滤膜(孔径∶0.45 μm∶有机系)滤过，弃去初滤液，取续滤液，备用。

1.2.3 阴性对照品溶液的制备 栀子苷、芍药苷、黄芩苷及大黄素分别来源于处方中栀子、芍药、黄芩及大黄药材，按防风通圣丸(水丸)的处方中各药味的比例和制备工艺，分别制备缺少栀子、缺芍药、缺黄芩、缺大黄的阴性对照样品，按照“1.2.2项”下供试品溶液配制方法制备各阴性对照样品溶液，即得。

1.3 色谱条件 色谱柱：Zorbax Eclipse XDB-C18键合硅胶色谱柱(4.6 m m×150 m m，5 μm)；柱温：室温；检测波长：240 nm(栀子苷、芍药苷)、275 nm(黄芩苷，大黄素)；流动相：乙腈(A)-2%磷酸溶液(B)，梯度洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序

1.3.1 分离度考察 分离度是用来判断物质在色谱柱中的分离情况，常用分离度作为色谱柱分离能力的指标，用R表示。其中R=2(tR1-tR2)/(W 1+W 2)。精密吸取上述防风通圣丸样品溶液，按上述色谱条件进样，进样量10 μL，结果见表2。

表2 分离度考察结果

由表2可见，栀子苷、芍药苷、黄芩苷和大黄素与相邻杂质峰之间的分离度均大于1.5，表明4种待测组分均能与杂质完全分离，分离效果良好。

1.3.2 专属性实验 精密吸取对照品混合溶液、供试品溶液、各阴性对照溶液，按上述色谱条件，分别进样分析，记录色谱图，结果在供试品溶液色谱图中，有与对照品混合溶液色谱图中栀子苷、芍药苷、黄芩苷及大黄素保留时间一致的特征峰，保留时间分别为6.71、10.428、19.712、33.512分钟。并且供试品峰之间基线较平稳分离度好，阴性对照样品色谱图中相应位置上无此特征峰，说明阴性对照样品对检测无干扰，结果表明本法的专属性良好，见图1—3。

图1 在240 nm处的H PLC图谱

图2 在275 nm处的H PLC图谱

图3 在275 nm处的H PLC图谱

1.3.3 拖尾因子实验 检查待测峰的拖尾因子是为了保证色谱柱的分离效果和测定精度。拖尾因子是通过计算5%峰高处峰宽与峰顶点至前沿的距离来评价峰形的参数，用T表示。其计算公式为：T=W 0.05h/2d1。式中W 0.05h为5%峰高处的峰宽；d1为峰顶点至峰前沿之间的距离。

精密吸取样品溶液，按上述色谱条件进样，进样量10μL，结果见表3。

表3 拖尾因子计算结果

由表3可见，栀子苷、芍药苷、黄芩苷和大黄素的拖尾因子介于0.95～1.05之间，符合《中国药典》规定，峰形良好。

1.3.4 理论板数计算 理论板数N用于评价色谱柱的效能，是色谱的柱效能参数之一。N取决于固定相的性质(粒度、粒径分布等)、填充状况、色谱柱柱长、流动相的种类好流速及测定柱效所用物质的性质。若峰形对称，则N可用下式表示：

式中tR表示保留时间，W h/2表示半高峰宽。

精密吸取上述混合对照品溶液，按上述色谱条件进样，进样量为10μL，结果见表4。

表4 理论板数计算结果

理论板数栀子苷为17 617，芍药苷为65 145，黄芩苷为185695，大黄素为129346。

2 结果

2.1 标准曲线与线性关系考察 精密吸取对照品混合溶液2，4，6，8，10，15，20 μL，按“1.3”项下色谱条件，进样测定，记录色谱图，以峰面积Y为纵坐标，以对照品进样量X(μg)为横坐标绘制标准曲线。栀子苷、芍药苷、黄芩苷及大黄素的标准曲线见图4—7。

图4 栀子苷标准曲线

图5 芍药苷标准曲线

图6 黄芩苷标准曲线

图7 大黄峰标准曲线

进行线性回归得回归方程：栀子苷：Y=2 888.0X-8.392 6，r=0.999 7，线性范围：0.056～0.56 μg；芍药苷：Y=836.13X-17.338，r=0.999 2，线性范围：0.103 5～1.029 7，黄芩苷：Y=1767.7X-133.42，r=0.999 3，线性范围：0.207 4～3.128 μg；大黄素：Y=299.1X-51.945 4，r=0.999 6，线性范围：0.04～0.423 μg。表明栀子苷，芍药苷、黄芩苷及大黄素的线性关系良好，见表5。

表5 栀子苷、芍药苷、黄芩苷及大黄素的标准曲线

2.2 精密度实验 精密吸取混合对照品溶液，按“1.3”项下色谱条件，连续进样6次，记录色谱图，进样量10 μL，栀子苷、芍药苷、黄芩、大黄素峰面积RSD(%)分别为1.23%、0.93%、1.02%和0.90%。表明仪器精密度良好，见表6。

表6 精密度考察结果（n=6）

2.3 重复性实验 取同一批号的防风通圣丸供试品(批号：90903)6份，每份约3g，分别精密称定，按“1.2”项下的制备方法平行制备供试品溶液6份，按“1.3”项下的色谱条件分别进样，进样量为15μL，记录色谱峰面积，计算各成分含量。

栀子苷、芍药苷、黄芩苷及大黄素的平均含量分别为0.584 2，0.755 2，5.672 0，0.628 9 m g/g，RSD分别为1.76%，2.21%，0.58%及0.91%。表明方法的重现性良好，结果见表7。

表7 重复性考察结果（n=6）

2.4 稳定性实验 取配制好的同一供试品溶液(批号：90903)，室温下放置，每2小时进样一次，进样量为15 μL，按“1.3”项下的色谱条件进行进样分析，并记录各时间下栀子苷、芍药苷、黄芩苷及大黄素的色谱峰面积，计算得峰面积RSD依次为1.81%、1.68%、0.58%、1.43%。表明本供试品在24小时内基本稳定，见表8。

表8 稳定性考察结果

2.5 加样回收率实验 精密称取已知含量的同一批号(批号：90903)防风通圣丸(水丸)6份，每份约3.0 g，按“1.2”项下的制备方法制备供试品溶液，分别精密量取上述溶液1.0 m L，置于5 m L容量瓶中，分别加入栀子苷对照品溶液(含栀子苷56 μg/m L)0.15m L、芍药苷对照品溶液(芍药苷100 μg/m L)0.2 m L、黄芩苷对照品溶液(黄芩苷106 μg/m L)0.4 m L、大黄素对照品溶液(大黄素49 μg/m L)0.15 m L，混合均匀，按上述含量测定项下的方法进行测定，进样量为15 μL，记录各色谱峰面积。按下式进行回收率计算，结果见表9。

表9 加样回收率实验结果（n=6）

回收率(%)=(测得值-样品中含量)/加入量×100%

2.6 样品含量测定 分别取3个不同批号的防风通圣丸(水丸)各3份，每份约3 g，精密称定，按“1.2”项下样品的制备方法平行制备各样品溶液，在上述色谱条件下进样测定，进样量15 μL，在240 nm、275 nm、波长处分别记录栀子苷、芍药苷、黄芩苷及大黄素的色谱峰面积，根据线性回归方程积计算防风通圣丸中栀子苷、芍药苷、黄芩苷及大黄素的含量，结果见表10。

表10 防风通圣丸（大蜜丸）含量测定结果

其中以防风通圣丸(水丸)(批号：90903)计算，取样量为2.998 9 g的一组数据为例，分别计算栀子苷、芍药苷、黄芩苷和大黄素的相关数据。由于样品待测成分浓度在其线形范围之内，根据样品配置过程和栀子苷、芍药苷、黄芩苷和大黄素的线性回归方程计算：

已知：栀子苷、芍药苷、黄芩苷和大黄素的峰面积分别为：Y=428.7，423.5，3406，1028.7。

1)批号090903样品中15μL样品栀子苷含量为：

X=(Y+8.3926)/2888.0 =(483.7+8.3926)/2888.0=0.1704 μg

因此样品中所含栀子苷为：

m1=0.170 4×50/15/2.9989=0.1682m g/g 2)芍药苷的含量为：

X=(Y+17.338)/836.13

=(423.5+17.338)/831.43=0.5302μg

因此样品中所含芍药苷为：

m2=0.5302×50/15/2.9989=0.5865m g/g 3)黄芩苷的含量为：

X=(Y+133.43)/1767.7

=（3406+133.43)/1767.7=2.0023μg

因此样品中所含黄芩苷为：

m3=2.0023×50/15/2.9989=2.225m g/g

4)大黄素的含量为：

X=(Y+51.945)/2996.1

=(1028+51.945)/2996.1=0.3686 μg

因此样品中所含大黄素为：

m4=0.3686×50/15/2.9989=0.4008m g/g

其他组的数据算法同上，计算结果见表10。

3 讨论

3.1 流动相的选择 实验过程中发现，在不同时间段内，改变流动相中乙腈的含量，即随着乙腈含量的增加，选择性增强，分离效果较明显。但是流动相中乙腈的比例过高会导致基线的飘移，拖尾因子的效果较明显。由于样品中所测成分的极性不同，因此考虑运用梯度洗脱，在不同的时间段内，逐渐提高乙腈的比例，使各成分先后出峰，找到最佳的有效成分分离条件。本实验中最终选择了乙腈-2%磷酸水溶液作为流动相，采用梯度洗脱程序，可使栀子苷、芍药苷、黄芩苷和大黄素与其他成分离开，且分离度好，拖尾因子效果较差。

3.2 检测波长的选择 本实验中3种物质在240 nm波长处都有吸收，栀子苷和芍药苷有最大吸收波长，而黄芩苷和大黄素的吸收很小，几乎测不到，故而本实验测定过程中选择双波长的检测模式，栀子苷和芍药苷在240 nm波长处有最大吸收波长，而黄芩苷和大黄素在275 nm波长处均有最大吸收波长，在该色谱条件下，色谱峰不拖尾，分离度好，阴性无干扰。

3.3 提取溶剂、提取方法及提取时间的选择 提取溶剂和处理方法对防风通圣丸(水丸)中栀子苷、芍药苷、黄芩苷和大黄素的含量测定有较大影响。在选择溶剂时用过甲醇，乙醇、甲醇和水的混合物，结果发现用甲醇提取时，所测物质的含量较高，其他成分干扰较少，所以本次实验制备样品溶液时采用甲醇进行提取。实验中还考察了30、40、50、60分钟超声提取法，对不同提取时间下的样品溶液分别进样比较发现，40、50分钟超声提取后所测的栀子苷、芍药苷、黄芩苷和大黄素的量基本相同，为了节约时间和减少杂质的含量，选择40分钟作为提取时间。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：中国医药科技出版社，2010：96-616.

［2］黄山君，杨琪伟，石燕红，等.一测多评法测定白芍中芍药苷与芍药内酯苷的含量［J］.中国中药杂志，2011，36（6）:780-783.

［3］李姝梅，阳敬，熊磊，等.高效液相色谱法测定柴藿颗粒中黄芩苷的含量［J］.儿科药学杂志，2012，18（3）:43-45.

［4］肖林林，温建东，吴坚.RP-H PLC法测定小柴胡汤丸中黄芩苷的含量［J］.中国现代药物应用，2011，5（22）:66-67.

［5］张广春，陈明明.高效液相色谱法测定安神养心丸中五味子醇甲的含量［J］.时珍国医国药，2011，22（7）:1783-1784.

Contents of Jasminoidin，Peoniflorin，Baicalin and Emodin in FangFeng TongSheng Pills Determined by RP-HPLC Method

YANG Xiaojun1，FANG Bowen1，DING Yonghui2
1 Chemical Engineering Institute of Northwest University for Nationalities，Lanzhou 730124，China；2 Gansu Food and Drug Administration

Objective:To establish the determination methods for the contents of jasminoidin，peoniflorin，baicalin and emodin in FangFeng TongSheng pills simultaneously by RP-HPLC.Methods:The contents were determined under different wavelengths by adopting RP-HPLC as gradient elution.Chromatographic column:Zorbax E-clipse XDB-C18bonded silica gel column（4.6 mm×150 mm，5 μm）；column temperature was room temperature；mobile phase:acetonitrile-2%phosphoric acid aqueous solution，gradient elution was adopted；flow rate 1.0mL/min；detection wavelengths were 240nm（jasminoidin and peoniflorin）and 275nm（baicalin and emodin）respectively.Results:Jasminoidin，peoniflorin，baicalin and emodin were in better linear relationship when their sample sizes were between 0.056 and 0.56g（r=0.999 7），0.103 5 and 1.029 7g（r=0.999 2），0.207 4 and 3.128 g（r=0.999 3），0.04 and 0.423 g（r=0.999 6），average recovery rates were 99.14%，99.65%，99.03%and 99.16%；RSD was 1.08%，1.01%，0.85%and 0.86%respectively.Conclusion:The method，simple，rapid，sensitive，reproducible and of high precision and accurate results，could be used for content determination of jasminoidin，peoniflorin，baicalin and emodin in FangFeng TongSheng pills simultaneously.

RP-HPLC；FangFeng TongSheng pills；jasminoidin；peoniflorin；baicalin；emodin；content determination

R927

A

1004-6852（2016）09-0027-08

2016-02-20

国家自然科学基金项目（编号21402153）。

杨小军（1982—），男，硕士学位，讲师。研究方向：药物分析。