贯叶连翘提取物对流感病毒感染小鼠免疫功能的影响

许珊丽，蒲秀瑛，杨晓华，郭爱军，岳 兰

1兰州市第一人民医院，甘肃 兰州 730050；2兰州理工大学生命科学与工程学院；3 兰州理工大学医院

贯叶连翘提取物对流感病毒感染小鼠免疫功能的影响

许珊丽1，蒲秀瑛2△，杨晓华3，郭爱军3，岳 兰3

1兰州市第一人民医院，甘肃 兰州 730050；2兰州理工大学生命科学与工程学院；3 兰州理工大学医院

目的：观察贯叶连翘提取物对流感病毒感染小鼠免疫功能的影响。方法：将昆明种小鼠40只随机分为模型对照组、正常对照组、达菲组（10 m g/kg）及贯叶连翘提取物高、低剂量组，每组8只。除正常对照组外，其余各组以流感病毒鼠肺适应株滴鼻感染小鼠后，分别灌服不同的药物（贯叶连翘提取物高剂量组100 m g/kg、低剂量组50 m g/kg和达菲组3 m g/kg）0.2 m L/次，2次/d，5天后摘眼球放血处死小鼠，摘取胸腺和脾脏并计算胸腺指数和脾脏指数；采用M TT法测定小鼠治疗前后T、B淋巴细胞转化率、巨噬细胞的吞噬功能及N K细胞的杀伤活性。结果：贯叶连翘提取物作用于流感病毒感染小鼠后，胸腺和脾脏指数均有所上升，与模型对照组相比差异有统计学意义（P＜0.05）；高、低贯叶连翘提取物组T、B淋巴细胞转化率、巨噬细胞的吞噬功能及N K细胞的杀伤活性与模型对照组相比上升明显（P＜0.01）。结论：贯叶连翘提取物对流感病毒感染小鼠机体有一定免疫调节作用。

流感病毒；免疫脏器指数；吞噬功能；淋巴细胞转化率；N K细胞活性；贯叶连翘提取物

流行性感冒(简称流感)是由流感病毒(In-fluenza virus，IFV)引起的一种发病率高、流行广泛、传播迅速的急性病毒性呼吸道传染病，是人类至今尚未能有效控制的世界性传染病之一。流感病毒侵袭机体，除了流感病毒直接作用于机体造成的损害以外，机体的免疫应答所造成的炎性损伤也起了至关重要的作用。从中药研究成果分析，中药在防治流感方面有着广阔的前景［1］。中药治疗流感，关键不在于对流感病毒的直接杀伤作用，而在于对机体免疫功能的调节。

贯叶连翘(Hypericum perforatum L.)属于藤黄科(Guttife-rae)金丝桃属多年生草本植物。近年来研究发现，该属植物具有抗病毒［2-3］、抗菌抗炎［4］和增强免疫功能［5］等药理活性。本课题组前期曾对贯叶连翘提取物的抗流感病毒作用进行研究，取得了良好效果［6］。为探讨贯叶连翘提取物是否通过调节机体免疫机能达到缓解流感的作用，揭示其抗流感机理，特进行本研究，通过贯叶连翘提取物对流感病毒感染小鼠的免疫功能的调节，探讨贯叶连翘提取物治疗流感的免疫作用机理，以期为贯叶连翘提取物的临床应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 药物 贯叶连翘采自甘肃陇南，经甘肃省药品检验所鉴定为藤黄科金丝桃属多年生草本植物的干燥叶。贯叶连翘提取物由中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所农业部新兽药工程重点开放实验室制备，含金丝桃素4.73%(高效液相色谱法测定)。用少量聚山梨酯溶解后以蒸馏水稀释成实验所用药物浓度。达菲(奥司他韦尔)由中国农业大学提供，纯度达95%。

1.2 病毒株 甲1型流感病毒鼠肺适应株(A/PR/8/1934)(IAV)由中国疾病预防控制中心提供，经10日龄鸡胚尿囊腔接种培养传代，微量血凝实验滴定病毒效价，血凝效价测定1∶512的病毒株为实验用毒株，液氮保存。正式实验前测定小鼠病毒半数致死量(LD50)为10-4.47。

1.3 实验动物 昆明种小鼠，体质量18～22 g，雌雄各半，由兰州大学动物实验中心提供，实验动物生产许可证号SCXK(甘)2013-0003；实验动物使用许可证号SYXK(甘)2013-0003。

1.4 试剂与仪器 脂多糖(LPS)，刀豆蛋白A (ConA)，1640培养基，二甲基亚砜(DMSO)和噻唑兰(MTT)均由Sigma公司提供；YAC-1细胞(上海天呈科技有限公司)；L-谷氨酰胺(Hualvyuan biotechnology)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；胰蛋白酶(Lvshengyuan biotechnology)；阿氏液和5%鸡红细胞悬液由本实验室自制；ZDX-35BI型座式自动电热压力蒸汽灭菌器(上海申安)、Thermo Biofuge Stratos低温离心机(上海赛默科技生物发展有限公司)、Thermo Multiskan MK3酶标仪(上海赛默科技生物发展有限公司)，FSH-2型可调高速匀浆器(武汉格莱莫监测设备有限公司)，JA2003N精密电子天平(上海精科天美仪器有限公司)等。

1.5 胸腺指数和脾脏指数的测定［7］将40只体质量18～22 g的昆明种小鼠随机分为模型对照组、正常对照组、达菲组(10 m g/kg)及贯叶连翘提取物高剂量组(100m g/kg)和低剂量组(50m g/kg)，雌雄各半，每组8只。除正常对照组外，各组在乙醚轻度麻醉下感染1/3 LD50甲1型流感病毒鼠肺适应株50 μL，于感染后4小时开始灌胃给药，0.2 m L/次，连续5天；正常对照组予同容积无菌蒸馏水灌胃。治疗5天后称体质量、摘眼球放血处死小鼠，剖胸腔摘取胸腺，打开腹腔摘取脾脏，以生理盐水洗涤2次，用滤纸吸干表面水份，用电子天平称其质量，按下列公式计算逐个计算：

胸腺指数=(小鼠胸腺重/小鼠体质量)×100

脾脏指数=(小鼠脾重/小鼠体质量)×100

1.6 T、B淋巴细胞转化率的测定［8］将感染及治疗5天后的小鼠摘眼球放血处死后，无菌摘取脾脏，研磨，过200目细胞筛，1 500 r/m i n离心10分钟，加入Tri s-N H4Cl溶液破坏红细胞，用PBS洗细胞2次，用完全RPM I-1640培养液重悬细胞，制得脾细胞悬液。显微镜下计数，用完全RPM I1640培养液调细胞浓度为2×106/m L，细胞悬液内一份加入ConA，使ConA终浓度为5 μg/m L，待测T淋巴细胞转化率；另一份加入LPS，使LPS终浓度为10 μg/m L，待测B淋巴细胞转化率。在96孔培养板中加200 μL/孔，4个重复孔，置37℃，5%CO2恒温培养箱中孵育48小时，每孔轻轻吸出上清液100μL，加入5m g/m L的M TT10μL/孔，置37℃，5% CO2恒温培养箱中孵育4小时，后加入10%SDS-H Cl 100 μL/孔，振荡，37℃过夜，酶标仪570 nm下测定各孔A值。以各样本A值代表其淋巴细胞的增殖能力。

1.7 小鼠脾脏的N K细胞杀伤活性的测定［9］将感染及治疗5天后的小鼠摘眼球放血处死后，无菌摘取脾脏，常规制备脾细胞悬液，培养4小时，去除贴壁细胞。调细胞浓度为2×106/m L，加入96孔细胞培养板中，每只小鼠4孔(2孔为测试孔，2孔为效应细胞对照孔)，50μL/孔。在测试孔内加入浓度为1×105/m LYAC-1细胞悬液50 μL/孔，使效靶比为20∶1；在对照孔中加入完全RPM I 1640培养液50μL/孔。同时另设3孔为靶细胞对照孔(浓度为1×105/m L靶细胞悬液50 μL/孔，再加入完全RPM I1640培养液50μL/孔)。混匀，置37℃，5% CO2恒温培养箱中孵育24小时，加5 m g/m L的M TT 10 μL/孔，置37℃，5%CO2恒温培养箱中孵育4小时，加入10%SDS-H Cl 100μL/孔，振荡，37℃过夜，酶标仪570nm下测定各孔A值。按下列公式换算成N K细胞活性的百分率：

N K细胞活性(%)=［1-(测试孔A值-对照孔A值)/靶细胞A值］×100%

1.8 小鼠巨噬细胞吞噬功能的测定［10］于感染后第5天，最后1次给药后24小时经腹腔注射5%鸡红细胞悬液0.5m L，间隔4小时后，腹腔再注射生理盐水2 m L，颈椎脱臼处死动物，轻揉腹部，然后剖开腹腔，轻轻吸出腹腔洗液，分滴于两张载玻片上，放入湿盒内，37℃孵箱孵育30分钟，孵毕，以生理盐水轻轻冲洗，洗去未贴壁的细胞，晾干，以丙酮∶甲醇(1∶1)溶液固定10分钟，再以10%(V/V)Gi em sa-磷酸缓冲液染色15分钟，蒸馏水冲洗自然晾干，镜检。选择染色清晰的视野，高倍镜下计数100个巨噬细胞，同时计数吞噬红细胞的巨噬细胞数，和吞噬的红细胞总数。然后按下列公式计算吞噬百分率和吞噬指数。

吞噬率=吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数×100%

吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数×100%

1.9 统计学方法 数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析，计量资料以(±s)表示，采用单因素方差分析，组间多重比较采用Dunnett-t检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1 贯叶连翘提取物对流感病毒感染小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响 流感病毒感染小鼠后，胸腺指数降低，与正常对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，采用贯叶连翘提取物和达菲治疗后胸腺指数有所回升，且高剂量贯叶连翘提取物组与模型对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，低剂量组与达菲组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。流感病毒感染小鼠后，脾脏指数降低，与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，采用贯叶连翘提取物和达菲治疗后脾脏指数明显上升(P＜0.05)；尤其以高剂量贯叶连翘提取物组上升更为显著，且与达菲组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，见表1。

表1 贯叶连翘提取物对流感病毒感染小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响(±s)

表1 贯叶连翘提取物对流感病毒感染小鼠胸腺指数和脾脏指数的影响(±s)

注：与模型对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与达菲组比较，▲表示P＜0.05。

组别 只数 剂量/（m g·kg-1） 胸腺指数 脾脏指数正常对照组 8 - 0.22±0.08** 0.46±0.014**模型对照组 8 - 0.09±0.02 0.32±0.027贯叶连翘提取物高剂量组 8 100 0.15±0.12* 0.43±0.011**▲贯叶连翘提取物低剂量组 8 50 0.12±0.07 0.41±0.025**达菲组 8 3 0.13±0.06 0.37±0.018*

2.2 贯叶连翘提取物对流感病毒感染小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响 各组小鼠的脾细胞，加ConA后，模型对照组吸光度A值降低，与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，加入贯叶连翘提取物和达菲后，A值显著上升(P＜0.01)。且高、低剂量贯叶连翘提取物组与达菲组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。各组小鼠的脾细胞，加LPS后，模型对照组A值降低，与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，加入贯叶连翘提取物和达菲后脾脏指数回升(P＜0.01)。且高、低剂量贯叶连翘提取物组与达菲组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

表 2 贯叶连翘提取物对流感病毒感染小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响(±s)

表 2 贯叶连翘提取物对流感病毒感染小鼠T、B淋巴细胞增殖的影响(±s)

注：与模型对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与达菲组比较，▲表示P＜0.05；▲▲表示P＜0.01。

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2.3 贯叶连翘提取物对流感病毒感染小鼠N K细胞活性的影响 流感病毒感染小鼠后，N K细胞活性降低(P＜0.01)，加入贯叶连翘提取物和达菲后N K细胞活性上升(P＜0.05)；尤其以高剂量贯叶连翘提取物组上升更为明显，且与达菲组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见表3。

表3 贯叶连翘提取物对流感病毒感染小鼠N K细胞活性的影响(±s)

表3 贯叶连翘提取物对流感病毒感染小鼠N K细胞活性的影响(±s)

注：与模型对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与达菲组比较，▲表示P＜0.05。

组别 只数 剂量/（m g·kg-1） N K细胞活性/%正常对照组 8 - 71.23±2.54**模型对照组 8 - 46.51±3.66贯叶连翘提取物高剂量组 8 100 63.27±1.25**▲贯叶连翘提取物低剂量组 8 50 60.18±3.41**达菲组 8 3 57.12±1.59*

2.4 贯叶连翘提取物对流感病毒感染小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响 模型对照组巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数降低，与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，贯叶连翘提取物和达菲组巨噬细胞的吞噬率和吞噬指数有所上升。尤其是高、低剂量贯叶连翘提取物组上升显著，与达菲组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见表4。

表4 贯叶连翘提取物对流感病毒感染小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响(±s)

表4 贯叶连翘提取物对流感病毒感染小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响(±s)

注：与模型对照组比较，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；与达菲组比较，▲表示P＜0.05，▲▲表示P＜0.01。

组别 只数 剂量/（m g·kg-1） 吞噬率/% 吞噬指数正常对照组 8 - 73.880±4.201** 7.541±0.413**模型对照组 8 - 51.410±3.422 5.092±0.441贯叶连翘提取物高剂量组 8 100 74.700±5.606**▲▲ 7.524±0.154**▲▲贯叶连翘提取物低剂量组 8 50 70.010±4.244**▲ 7.109±0.012**▲达菲组 8 3 63.920±3.543* 6.065±0.173*

3 讨论

贯叶连翘在民间已有2400年的药用历史，传统中医药学认为，该属植物具有清热解毒、消肿止血、利湿止痛等功效。机体免疫功能包括非特异性免疫与特异性免疫两大方面。非特异性免疫是指对所有病原微生物都有一定程度的抵抗能力，又称为天然免疫或先天性免疫。特异性免疫是指机体针对某一种或某一类微生物或其产物所产生的特异性抵抗力，包括体液免疫和细胞免疫。胸腺和脾脏是动物体内主要的免疫器官。免疫器官的重量是反应机体非特异性免疫功能重要而直观的指标，胸腺和脾脏指数能反映免疫器官的发育和免疫细胞的功能状况。

在非特异性免疫的基础上，机体能产生针对病毒等病原体的特异性免疫应答，根据在免疫应答中起主要作用的免疫活性细胞的不同，可将其分为细胞免疫(T细胞介导的免疫应答)和体液免疫(B细胞介导的免疫应答或抗体应答)两大类。免疫系统中的T细胞分支进化到主要对感染细胞的监视，而B细胞产生的抗体主要抵御游离病毒［11］。所以，B淋巴细胞的增殖可以反映体液免疫的水平，T淋巴细胞的增殖可以反映细胞免疫的水平。淋巴细胞增殖的高低可以反映机体细胞免疫及体液免疫的水平。腹腔巨噬细胞具有高度的吞噬能力，不仅担负着机体非特异性免疫的防御机能，而且有参与调节免疫应答的功能。而N K细胞是先天性免疫中一类十分重要的淋巴细胞，通过其细胞毒活性和产生淋巴因子，在机体抗感染、免疫调节等方面发挥重要的免疫功能。

本研究通过贯叶连翘提取物对流感病毒感染小鼠免疫器官质量、T、B淋巴细胞的增殖功能、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能和对N K细胞活性的影响，在一定程度上综合反映了贯叶连翘提取物对流感病毒感染机体的细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫能力的影响，体现整个机体免疫系统的功能水平。

结果显示：贯叶连翘提取物与达菲作用于流感病毒感染小鼠后胸腺指数和脾脏指数有所回升，脾脏指数的增加更为显著，与模型对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。模型对照组的淋巴细胞增殖(包括T淋巴细胞增殖和B淋巴细胞增殖)较正常对照组降低(P＜0.01)，说明流感病毒感染能显著抑制小鼠的淋巴细胞增殖，从而抑制机体免疫功能；而贯叶连翘提取物和达菲均能增加流感病毒感染小鼠N K细胞活性(P＜0.05)，提示贯叶连翘提取物可提高流感病毒感染小鼠的免疫功能状态，并且以提高机体细胞免疫为主。同时也可看出：流感病毒感染小鼠后，模型对照组巨噬细胞的吞噬功能和N K细胞活性最小，与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01)，说明流感病毒可明显抑制小鼠巨噬细胞的吞噬功能和N K细胞的杀伤活性，采用贯叶连翘提取物和达菲干预后，吞噬功能和N K细胞杀伤活性较模型对照组有明显提高(P＜0.01)，且与达菲相比差异显著，提示贯叶连翘提取物同样可明显提高流感病毒感染小鼠非特异性免疫功能。

综上所述，贯叶连翘提取物可明显增强流感病毒感染小鼠的细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫作用。

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The Influence of GuanYe LianQiao Extract on the Immunologic Function of Influenza Virus-infected Mice

XU Shanli1，PU Xiuying2△，YANG Xiaohua3，GUO Aijun3，YUE Lan3
1 The First People′s Hospital of Lanzhou City，Lanzhou 730050，China；2 School of Life Science and Engineering of Lanzhou University of Technology；3 The Hospital of Lanzhou University of Technology

Objective:To survey the effects of GuanYe LianQiao（Hypericum perforatum L.）extract on the immunologic function of influenza virus-infected mice.Methods:Forty mice were randomized into model control group，normal control group，tamiflu group （10 mg/kg），high and low dosage groups of GuanYe LianQiao extract，eight mice each group.Except normal control group，the mice in other groups were infected by dripping of influenza virus mice lung adaptive strain，and accepted the drenching of different herbs（high and low dosages of GuanYe LianQiao extract，100mg/kg and 50mg/kg，and tamiflu group，3mg/kg），0.2mL each time，twice per day，the eyeballs were taken out in five days and the mice were sacrificed，the thymus gland and the spleen were taken out，thymus index and spleen index were calculated；T and B lymphocyte transformation rates，phagocytic function of macrophage and killing activity of NK cells of the mice were determined before and after treating by adopting MTT method.Results:thymus index and spleen index raised after influenza virus-infected mice were given GuanYe LianQiao extract，there was significant difference compared with model control group （P＜0.05）；T and B lymphocyte transformation rates phagocytic function of macrophage and killing activity of NK cells raised obviously compared with model control group（P＜0.01）.Conclusion:GuanYe LianQiao extract shows certain immunoregulation effects to the influenza virus-infected mice.

influenza virus；immune organ index；phagocytic function；lymphocyte transformation rate；NK cell activity；GuanYe LianQiao extract

R285.6

A

1004-6852（2016）09-0023-05

2015-03-27

许珊丽（1967—），女，主任医师。研究方向：心血管疾病的诊治。

△通讯作者：蒲秀瑛（1968—），女，硕士研究生导师，博士学位，副教授。研究方向：药理学和毒理学研究。