细菌纤维素的制备及其对LBKP性能的影响

马英辉　李利军　卢美欢　王银存

(1.陕西省微生物研究所,陕西西安,710043；2.西北大学,陕西西安,710069)



·细菌纤维素·

细菌纤维素的制备及其对LBKP性能的影响

马英辉1李利军1卢美欢1王银存2

(1.陕西省微生物研究所,陕西西安,710043；2.西北大学,陕西西安,710069)

探讨了以秸秆水解液作为唯一碳源生产细菌纤维素的工艺参数,并考察了细菌纤维素湿膜对漂白硫酸盐阔叶木浆(LBKP)纸张性能的影响。实验结果表明,以秸秆水解液作为唯一碳源,采用动静两步法制备细菌纤维素的最大产量为4.27 g/L；细菌纤维素湿膜添加到LBKP中能够明显提高纸张抗张指数、撕裂指数、耐破指数、耐折度、透气度等物理性能。

细菌纤维素；秸秆水解液；LBKP；纸张性能

细菌纤维素(BC)是由细菌合成的一种高性能纳米纤维素材料,作为一种新兴的高分子材料,具有传统纤维素所无法比拟的物理、化学性质,直径为植物纤维的1/100,其弹性模量高达1.5×1010Pa,与铝相当[1]。细菌纤维素因其具有高纯度[2]、高结晶度、高聚合度、高持水能力、较好的生物相容性和可降解性等优点,广泛应用于音响膜、人工血管[3]、复合材料、无纺布等重要领域。细菌纤维素在造纸工业中也已表现出广阔的应用前景[4],如在涂料、增稠剂、增强剂、胶黏剂、高强度纸张、防伪纸制品、高品质薄型印刷纸、可循环使用的婴儿尿布等方面的开发应用。但目前细菌纤维素的产量低,生产成本还较高,价格较贵,使得其应用局限于某些高附加值产品的制造过程中[5]。

利用木质纤维废弃物水解液作为碳源生产细菌纤维素能够显著降低其成本[6],本课题将以秸秆水解液为碳源,研究制备细菌纤维素的工艺参数,降低细菌纤维素的制备成本,促进细菌纤维素在造纸工业中的应用。

1　实　验

1.1菌株

GluconacetobacterHC-N,实验室保存,从土壤中分离获得,并经过秸秆水解液诱导的菌株。

1.2实验仪器设备

培养箱、恒温摇床、722可见分光光度计、搅拌器、光学显微镜、耐折度仪(GT- 6014-A)、卧式抗张强度仪(L&W SE060)、耐破度仪(SE180)、透气度仪(4110- 4320-1)、撕裂度仪(SE009)、纤维疏解机(model500-1)、抄纸机(HK-CP01)、旋转蒸发仪(N-1200BV-OSB2100)、扫描电镜(6700F)。

1.3实验原料

秸秆水解液[7]：秸秆粉碎后经过多聚磷酸与生物酶处理,层析柱纯化后,真空浓缩为糖浓度10%的液体。

活化培养基：牛肉膏蛋白胨培养基。

诱导培养基：秸秆水解液,调整糖浓度为2%。

基础发酵培养基：秸秆水解液糖含量2%,蛋白胨0.5%,酵母粉0.5%,磷酸氢二钠0.27%,柠檬酸0.115%,硫酸镁0.025%,121℃灭菌20 min后加无水乙醇2%。

1.4实验方法

1.4.1GluconacetobacterHC-N菌株的活化与诱导

1.4.1.1菌种活化

将GluconacetobacterHC-N接种于固体活化培养试管中,30℃活化16 h,待长出菌落后,接种于液体活化培养基中,180 r/min、30℃摇瓶培养24 h。

1.4.1.2秸秆水解液诱导

将活化好的液体种子按10%～15%的接种量接种于糖浓度为2%的秸秆水解液中,180 r/min摇瓶培养,每隔4 h测定种子液吸光度(OD)值(600 nm),直到OD值达到1.5以上时,取出待用。

1.4.2细菌纤维素制备工艺优化

1.4.2.1培养方式研究

采用基础发酵培养基分别进行150 r/min摇瓶培养7 d、30℃静置培养7 d、先150 r/min摇瓶40 h培养再静置5 d的培养，并对其进行对比，以找到秸秆水解液为唯一碳源的最佳培养方式。

1.4.2.2培养基及培养条件研究

利用design-expert软件设计因素水平实验,考查碳源浓度、氮源种类及配比、合成因子种类及浓度以及培养条件对菌株GluconacetobacterHC-N发酵秸秆水解糖制备细菌纤维素产量的影响,从而获得以秸秆水解液为唯一碳源的最佳细菌纤维素制备工艺。

1.4.3细菌纤维素产量计算方法

将发酵获得的细菌纤维素膜进行酸洗、碱洗以除去菌体，用蒸馏水洗至中性，80℃干燥4 h，称重。

1.4.4细菌纤维素对LBKP性能的影响

将发酵获得的细菌纤维素湿膜进行酸洗、碱洗以除去菌体,用蒸馏水冲洗至中性,然后采用疏解分散机进行分散,剪切转速为3000 r/min,剪切60 min,剪切分散,细菌纤维素用量分别为0.5%、1%、2%(对LBKP绝干量),然后进行打浆、抄造手抄片,按照相应国家标准测定手抄片的定量、厚度、松厚度、透气度、耐折度、抗张指数、撕裂指数、耐破指数。

2　结果与讨论

2.1菌株GluconacetobacterHC-N在以秸秆水解液为唯一碳源诱导培养基中的生长情况

图1为菌株在诱导培养基中的生长情况。从图1可以看出,菌株在前20 h处于调整期,菌体浓度基本无明显的增长,这是由于秸秆水解液中存在一定量的多酚类物质[8],一定程度上抑制了菌体的过快生长,不利的生长环境延长了菌株的调整期；20 h后,菌体浓度开始呈对数上升,40 h时OD值已经达到2.0左右,说明菌株对恶劣的环境已经适应；40 h后由于培养液营养耗尽,菌体浓度处于较稳定的状态。从图1中OD达到2.0所需的时间来看,由于唯一碳源和抑制因子的存在,使得菌株GluconacetobacterHC-N的生长周期变长。

图1　Gluconacetobacter HC-N在诱导培养基中的生长曲线

2.2培养方式研究

图2为不同培养方式对细菌纤维素产量的影响。从图2可见,在不同的培养方式下,细菌纤维素产量差别较大,摇瓶培养7 d时的细菌纤维素产量最低；而先摇瓶40 h后再静置培养5 d时细菌纤维素产量最高,达到3.2 g/L,因为秸秆水解液中含有抑制菌体生长的成分,菌体需要消耗大量的氧气来抵抗水解液中的不良成分,摇瓶40 h后,菌体达到一定浓度,菌体进入了稳定期开始合成细菌纤维素,此时再静置培养5 d 有利于纤维素链的延伸[9]和保持较高的杨氏模量,所以先摇瓶后静置的培养方式下细菌纤维素的产量最高。

图2　不同培养方式对细菌纤维素产量的影响

2.3细菌纤维素制备工艺的单因素实验

2.3.1秸秆水解液糖浓度对细菌纤维素产量的影响

图3所示为秸秆水解液碳源浓度对细菌纤维素产量的影响。从图3中可以看出,菌株GluconacetobacterHC-N以葡萄糖作为碳源时,随着葡萄糖浓度的增加,细菌纤维素产量随之上升,在葡萄糖浓度约3%时,细菌纤维素产量达到最大,后随碳源浓度的增加,细菌纤维素的产量趋于稳定；而以秸秆水解液作为碳源时,由于水解液中多酚类物质的存在,所以细菌纤维素产量会随着秸秆水解液糖浓度的增加先增大后减小[10],依据图3的趋势线,当秸秆水解液中糖浓度为2%左右时,细菌纤维素产量最大。

图3　秸秆水解液糖浓度对细菌纤维素产量的影响

2.3.2添加氮源种类及浓度对细菌纤维素产量的影响

以秸秆水解液为唯一碳源的情况下,实验了5种速效氮源对细菌纤维素产量的影响，结果见图4。图4显示,有机氮源更能促进细菌纤维素的合成,是因为有机氮源的营养更丰富,能够更有利于菌株对不良环境的克服,与文献[11]报道相同。酵母粉和蛋白胨对细菌纤维素的产量影响差别很小,但酵母粉在浓度为0.6%时,细菌纤维素产量最先达到高值,所以综合考虑,酵母粉的浓度为0.6%。

图4　氮源及其浓度对细菌纤维素产量的影响

2.3.3添加乙醇、琼脂、壳聚糖对细菌纤维素产量的影响

高分子聚合物如壳聚糖、琼脂、明胶可改变发酵液黏度,也可改变细菌合成纤维素时纤维丝的装配,从而可影响细菌的代谢途径,诱导或阻碍细菌纤维素的合成[12]。而乙醇作为细菌纤维素的能源物质[13],对传统木醋杆菌生产细菌纤维素具有促进作用,但针对此菌株且在以秸秆水解液为唯一碳源的培养基中,乙醇的加入是否有促进作用还未知,所以,本实验通过采用用量1 g/L的琼脂、壳聚糖、明胶和体积分数2%的乙醇考察其对细菌纤维素合成的影响，结果见图5。

图5　乙醇与高分子物质对细菌纤维素产量的影响

从图5可以看出,乙醇的添加能够明显促进细菌纤维素的合成,可能是因为菌株在生长过程中会形成乙醇中间体,而后才合成纤维素,乙醇的加入能够提高乙醇中间体的浓度,促进菌体进入下游纤维素的合成阶段；而高分子物质琼脂和明胶效果与对照样差别不大,与文献[14]报道的有所差别,原因可能是秸秆水解液削弱了琼脂与明胶的增强作用；壳聚糖由于具有抑制菌株生长的作用,所以加入后明显不利于细菌纤维素的合成；而乙醇与高分子物质的混合加入,并没有显著提高细菌纤维素的合成效率。

2.3.4培养温度、初始pH值对细菌纤维素产量的影响

图6和图7分别显示了培养温度和pH值对细菌纤维素合成的影响。由图6可知，当培养温度为28℃时,细菌纤维素的产量达到最大，为3.53 g/L,后随着温度的升高,细菌纤维素产量呈下降趋势。由图7可知，当初始pH值为5和7时,细菌纤维素的产量无明显差别,应在下一步的实验中继续研究。

图6　培养温度对细菌纤维素合成的影响

图7　初始pH值对细菌纤维素合成的影响

2.4细菌纤维素制备工艺的Box-Behnken实验

根据单因素实验的结果,利用Design-expert 8.0设计Box-Behnken实验,实验方案及实验结果如表1和表2所示。

表1　Box-Behnken水平实验方案

表2　Box-Behnken实验结果

由表3可见,在95%的置信区间内,用Design-expert最小误差原则去掉不显著项,拟合成的方程为：y=-9.2+0.8A+2.2B+3.1C+0.12AC-0.27A2-0.36B2-0.31C2。

图8为该模型的学生化残差分布图。由图8可以看出,其残差各点的分布几乎在一条直线上,说明模型拟合效果较好。

表3　各因子对响应值的影响显著程度

图8　模型内学生化残差分布图

根据数学模型中各影响因素系数的绝对值大小可以看出各影响因素对细菌纤维素产量影响的强度。系数绝对值越大,该因素对因变量的影响越大。由此可知,单因素对细菌纤维素产量影响的强弱顺序为pH值(C)>乙醇浓度(B)>碳氮比(A)，碳氮比与pH值的交互作用(AC)对细菌纤维素的产量影响最大。模型的参数优化与验证结果见表4。

表4　参数验证

从表4可以看出,在碳氮比为3∶1、乙醇用量为3%、初始pH值为6.0时,细菌纤维素的产量为4.27 g/L,与模型的相对误差仅为2.5%左右。说明Design-expert 8.0软件所建立的细菌纤维素产量与碳氮比、乙醇浓度、pH值关系模型准确、可靠。

综上可知，以秸秆水解液为唯一碳源的细菌纤维素的最佳制备条件为：秸秆水解糖含量2%、酵母粉0.7%、磷酸氢二钠0.27%、柠檬酸0.115%、硫酸镁0.025%,初始pH值为6.0,灭菌后接种前加入用量3%的无水乙醇,30℃、150 r/min摇瓶培养40 h,然后28℃静置5 d,至液体培养基被消耗殆尽为止。

表5　添加细菌纤维素对LBKP性能的影响

图9　细菌纤维素照片

此条件下获得的细菌纤维素的产量为4.27 g/L。

2.5细菌纤维素对LBKP性能的影响

2.5.1细菌纤维素分散前的照片

图9为细菌纤维素的显微镜及SEM照片。从图9中可以看出,细菌纤维素细长,长径比远高于普通化学浆纤维,因此,细菌纤维素极难分散成单根纤维,而是多根纤维的聚集体。如果分散不彻底,那么纤维素分子链上的游离羟基就无法很好地暴露出来,造成与植物纤维的结合不好[15],其手抄片的强度就会受到影响,不仅无法提高纸张性能,反而会因为其颗粒较大阻碍植物纤维间的结合,严重影响手抄片的强度。

2.5.2纸张性能测试

表5为添加不同用量细菌纤维素对LBKP性能的影响。从表5中明显看出,添加一定量的细菌纤维素后,LBKP纸张的透气度、耐折度、撕裂指数和耐破指数都有所增加,而纸张的松厚度、抗张指数变化不太明显,这与文献[16]报道有所差别,主要原因是纸浆不同所致,即细菌纤维素对不同纸浆性能的增强效果不同,同时也与细菌纤维素的分散工艺有关,分散不完全会影响抄纸的各项指标,但从总体来说,细菌纤维素的适量加入有利于改善纸张性能。

3　结　论

3.1以秸秆水解液作为唯一碳源,采用动静结合两步法合成养细菌纤维素的最佳条件为:秸秆水解糖含量2%、酵母粉含量0.7%、磷酸氢二钠0.27%、柠檬酸0.115%、硫酸镁0.025%,初始pH值为6.0,灭菌后接种前加入3%的无水乙醇,30℃、150 r/min摇瓶培养40 h,然后28℃静置5 d,获得细菌纤维素产量为4.27 g/L。

3.2细菌纤维素湿膜添加到漂白硫酸盐阔叶木浆(LBKP)中能够改善纸张的物理性能,但由于细菌纤维素性状的特殊性,细菌纤维素的分散工艺与不同纸浆的结合能力还需进一步研究。

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(责任编辑：刘振华)

Bacterial Cellulose Preparation Using Straw Hydrolysate and Its Effect on LBKP Performance

MA Ying-hui1,*LI Li-jun1LU Mei-huan1WANG Yin-cun2

(1.ShaanxiProvinceInstituteofMicrobiology,Xi’an,ShaanxiProvince, 710043; 2.NorthwestUniversity,Xi’an,ShaanxiProvince, 710069)

(*E-mail： yinghuima@163.com)

Bacterial cellulose was prepared by using straw hydrolysate which was the only carbon source, then physical properties of the LBKP paper adding wet bacterial cellulose were studied. The result showed that the max dry production of bacterial cellulose was 4.27 g/L. Using two-step fermentation process with straw hydrolysate as carbon source, the physical properties of the paper adding the wet bacterial cellulose including tensile index, tear index, burst index, folding endurance and air permeability were obviously improved.

bacterial cellulose; straw hydrolysate; LBKP; paper performance

马英辉先生,助理研究员；研究方向：资源环境微生物。

2015-12-22(修改稿)

陕西省科学院科技计划项目2015K-14。

TS722

ADOI：10.11980/j.issn.0254- 508X.2016.06.005