酶水解对亳菊总黄酮中黄酮苷元的影响

闫　攀,左亚峰, 张　伟,2,3,吴德玲,2,3,许凤清,3,金传山,2,刘劲松,3,方成武

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥　230012 ；2.安徽省中药饮片产地加工与炮制一体化关键技术研究创新团队，安徽 合肥　230012；3.安徽省中医药科学院药物化学研究所，安徽 合肥　230012)



酶水解对亳菊总黄酮中黄酮苷元的影响

闫攀1,左亚峰1, 张伟1,2,3,吴德玲1,2,3,许凤清1,3,金传山1,2,刘劲松1,3,方成武1

(1.安徽中医药大学药学院，安徽 合肥230012 ；2.安徽省中药饮片产地加工与炮制一体化关键技术研究创新团队，安徽 合肥230012；3.安徽省中医药科学院药物化学研究所，安徽 合肥230012)

目的体外研究烘干过程中酶对亳菊总黄酮成分的影响，为亳菊产地加工和炮制工艺提供前期研究基础。方法模拟亳菊烘干过程，采用β-D-葡萄糖苷酶酶解亳菊总黄酮，以金合欢素、芹菜素、木犀草素3种黄酮苷元含量为指标，分析酶解反应对3种黄酮苷元含量变化的影响。结果酶解反应后，亳菊总黄酮中木犀草素、芹菜素、金合欢素3种黄酮苷元的含量升高。结论β-D葡萄糖苷酶可酶解亳菊中黄酮类成分，使其中黄酮苷元含量升高，β-葡萄糖苷酶水解亳菊总黄酮是烘干过程中黄酮苷元含量升高的原因之一。

β-D葡萄糖苷酶；亳菊；黄酮

亳菊具有明目平肝、疏风清热的功效[1]，一直被认为是药用菊花中的佳品。现代研究表明，亳菊中含有黄酮类化合物、苯丙素类化合物以及挥发油等主要成分，其中黄酮类成分是其降血压主要有效成分[2]。亳菊传统的加工方法是悬挂阴干的干燥方式[3-4]，已经难以适应目前大规模加工新鲜菊花的要求。前期研究结果[5]显示，在经过烘干加工后的亳菊中的木犀草素苷等黄酮苷类成分较阴干的样品含量降低，而对应苷元含量则相对升高，同时亳菊中提取得到的粗酶液基本具备β-D-葡萄糖苷的基本特性[6]，推测其原因可能是加热过程激活亳菊中分解黄酮苷的酶活性，引起黄酮苷类化合物分解。植物来源的β-葡萄糖苷酶最早发现于苦杏仁中，该酶广泛存在于自然界中，具有许多重要的生物学功能，有学者对来源于茶叶、栀子花、茉莉花的β-葡萄糖苷酶进行研究时发现，β-D-葡萄糖苷酶在醇系香气的形成中起到重要作用[7-9]，说明植物来源的β-D-葡萄糖苷酶对于植物中相关成分具有一定的影响。为验证亳菊在加工过程中黄酮苷含量降低，黄酮类苷元升高是由于亳菊中酶水解黄酮苷产生苷元的猜想，本实验模拟亳菊加工过程，采用β-D葡萄糖苷酶与亳菊总黄酮进行体外反应，研究酶在亳菊烘干过程中酶对亳菊中黄酮类成分的影响，为亳菊合理的产地加工炮制工艺提供前期研究基础。

1　仪器与试药

Waters 1525型高效液相色谱仪(包括Waters 1525 Binary HPLC Pump，Waters 2498 UV/Visible Detecor，Waters 2707 Autosampler)；十万分之一分析天平(AB135-S，瑞士梅特勒-托利多)；PALL-Life Scienses一体式超纯水系统(美国颇尔公司)；Agilent HC-C18(2) 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

β-D葡萄糖苷酶(sigma公司，7.4 U/mg)，亳菊总黄酮(实验室自制，批号 20151208)，金合欢素(实验室自制，纯度≥98%)，木犀草素、芹菜素(武汉天植生物技术有限公司，批号CFN 98843，纯度≥98%)；乙腈(瑞典OCEANPAK欧普森公司，色谱纯)；水为纯净水。

2　样品的测定

2.1对照品溶液的配制分别精密称取对照品木犀草素5.26 mg、金合欢素5.31 mg、芹菜素5.16 mg至10 mL容量瓶中，用70%甲醇定容，制成每毫升含有木犀草素0.526 mg、金合欢素0.531 mg、芹菜素0.516 mg的对照品溶液；精密称取适量的β-D-葡萄糖苷酶配制成酶活力分别为1、2、3、5、7、10、13、15、18、20、30 U/mL酶活力的水溶液，低温密封避光保存备用。

2.2样品溶液的制备

2.2.1亳菊总黄酮样品的制备精密移取0.2 mL水和甲醇1 mL注入2.5 mL EP管中，然后注入2 mg/mL的亳菊总黄酮水溶液0.2 mL于50 ℃水浴中加热溶解，将溶液以0.22 μm有机滤膜滤过，得亳菊总黄酮样品。

2.2.2酶失活组样品制备精密移取20 U/mL的β-D葡萄糖苷酶水溶液0.2 mL与甲醇1 mL先后注入2.5 mL EP管中使酶失活，然后注入2 mg/mL的亳菊总黄酮水溶液0.2 mL于50 ℃水浴中反应1 h，将反应液以0.22 μm有机滤膜滤过，得到酶失活反应组样品。

2.2.3酶解反应组样品制备精密移取20 U/mL的β-D葡萄糖苷酶水溶液0.2 mL与2 mg/mL的亳菊总黄酮水溶液各0.2 mL先后注入2.5 mL EP管中,在50 ℃水浴环境下反应60 min，随后立即注入1 mL甲醇终止反应，将反应液以0.22 μm有机滤膜滤过，得到酶解反应组样品。

2.3样品的测定方法采用高效液相色谱法，Agilent HC-C18(2) 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，检测波长为330 nm，柱温为30 ℃，以流动相：乙腈(A)-0.1%磷酸水溶液(B)，线性梯度洗脱(见表1)，流速为1.0 mL/min，进样量20 μL，对样品进行测定，结果见图1、图2。

以木犀草素峰面积(Y1)，芹菜素面积(Y2)和金合欢素面积(Y3)为纵坐标对进样浓度X(μg/mL)进行线性回归，得回归方程，Y1=65 062X，r=0.999；Y2=89 644X，r=0.999 5；Y3=100 625X，r=0.999 5，结果表明木犀草素进样浓度在0.17～13.6 μg/mL，芹菜素进样浓度在0.645～21.6 μg/mL，金合欢素进样浓度在0.66～53.1μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

表1　梯度洗脱系统

注：S1为木犀草素；S2为芹菜素；S3为金合欢素。

图1对照品色谱图

3　不同因素对亳菊总黄酮酶解反应的影响

3.1不同温度对亳菊黄酮酶解反应的影响精密移取20 U/mL的β-D葡萄糖苷酶溶液与2 mg/mL的亳菊黄酮水溶液各0.2 mL先后注入2.5 mL EP管中，分别在30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃的水浴环境下反应2 h，然后立即向EP管中注入1 mL甲醇终止反应，将反应溶液以0.22 μm有机滤膜滤过，取续滤液为样品，进行高效液相色谱分析，并以木犀草素、芹菜素和金合欢素对应的浓度为指标，找出最适反应温度。

注：Y1为酶水解亳菊总黄酮样品；Y2为酶失活水解总黄酮样品；Y3为亳菊总黄酮；1为木犀草素；2为芹菜素；3为金合欢素。

图2样品色谱图

3.2不同酶活力对亳菊黄酮苷转化反应的影响精密移取酶活力为1、2、3、5、7、10、13、15、18、20、30 U/mL的β-D葡萄糖苷酶溶液与底物浓度为2 mg/mL的亳菊总黄酮水溶液各0.2 mL，在50 ℃的水浴环境下反应2 h，然后立即向EP管中注入1 mL甲醇终止反应，将反应溶液以0.22 μm有机滤膜滤过，取续滤液为样品，进行高效液相色谱分析，并以木犀草素、芹菜素和金合欢素对应的浓度为指标，找出最适反应酶活力。

3.3不同反应时间对亳菊黄酮苷转化反应的影响精密移取酶活力为20 U/mL的β-D葡萄糖苷酶溶液与2 mg/mL的亳菊总黄酮水溶液各0.2 mL先后注入2.5 mL EP管中，在50 ℃水浴环境下分别反应5、15、30、45、60、75、90、120 min，随后立即注入1 mL甲醇终止反应，进行液相分析，找出最适反应时间。

4　结果

4.1酶解反应前后黄酮苷元变化量的测定实验结果表明，与酶失活组比较，酶解反应组黄酮苷元含量升高，表明β-D葡萄糖苷酶酶解反应可促使亳菊中黄酮类成分发生转化，从而使其内部黄酮苷元的含量增加，见表2、图2。实验结果中黄酮类成分变化与加热烘干亳菊过程中黄酮类成分的变化一致。

表2　样品黄酮苷元浓度(n=3)

注：“-”表示低于样品测量下限，无法测定。

4.2不同温度对亳菊总黄酮酶解反应的影响不同温度下亳菊总黄酮与β-D葡萄糖苷酶溶液反应后最终黄酮苷元的峰面积变化见图3。结果显示，在30～50 ℃水浴环境下，黄酮苷元含量随着温度升高而逐渐升高，当水浴温度高于50 ℃时，随着温度升高黄酮苷元含量总体呈下降趋势，说明在水浴温度为50 ℃时β-D葡萄糖苷酶活力最高，反应最完全，因此选择50 ℃水浴温度进行酶解反应。

图3　不同温度对酶解反应的影响

4.3不同酶活力β-D葡萄糖苷酶溶液对亳菊总黄酮的影响不同酶活力β-D葡萄糖苷酶溶液与亳菊总黄酮反应后黄酮苷元的峰面积结果见图4。β-D葡萄糖苷酶酶解黄酮苷时，在0～20 U/mL阶段随着酶活力升高，黄酮苷元含量逐渐增多，在20～30 U/mL酶活力持续升高，黄酮苷元含量基本保持不变，因此选择酶活力为20 U/mL的β-D葡萄糖苷酶溶液作为最适酶活力溶液参与反应。

图4　 不同酶活力对酶解反应的影响

4.4不同反应时间对亳菊总黄酮酶解反应的影响β-D葡萄糖苷酶溶液与亳菊总黄酮分别进行不同时长的反应后，黄酮苷元的色谱峰面积结果如图5所示。结果显示，在0～60 min，随着反应时间的延长，黄酮苷元含量不断增加，在60 min时达到最大值，此后随着反应时间逐渐增加，黄酮苷元含量先保持不变，继而开始降低。因此，β-D葡萄糖苷酶与亳菊总黄酮反应的最佳反应时长为60 min。

图5　不同反应时间对酶解反应的影响

5　讨论

通过对各样品中3种黄酮苷元含量进行比较，发现与酶失活组比较，酶解反应组和亳菊总黄酮组黄酮苷元含量升高，表明亳菊总黄酮在酶解条件下会导致黄酮苷元含量升高，这种现象与亳菊加热加工中亳菊样品中黄酮类化合物的变化一致，进一步验证亳菊在烘制条件下黄酮苷元含量升高可能是由加热过程中酶解反应所致的推测。

本研究以亳菊总黄酮为底物，考察酶解温度、酶活力、反应时间3个单一因素，对β-D葡萄糖苷酶水解亳菊总黄酮反应的条件进行研究。结果显示，酶解温度对亳菊总黄酮酶解反应的影响最为显著，后期将结合文献[10-11]对β-D葡萄糖苷酶水解亳菊总黄酮反应条件进行优化，研究不同酶水解因素在水解亳菊总黄酮过程中的影响。亳菊体内反应环境复杂，成分变化原因多样，因此，亳菊内生酶对于亳菊加工过程中黄酮类成分变化的影响有待于进一步研究。

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Influence of Enzyme Hydrolysis on Flavonoid Aglycones in Total Flavonoids in Chrysanthemum morifolium Ramat. from Bozhou

YANPan1,ZUOYa-feng1,ZHANGWei1,2,3,WUDe-ling1,2,3,XUFeng-qing1,3,JINChuan-shan1,2,LIUJin-song1,3,FANGCheng-wu1

(1.SchoolofPharmacy,AnhuiUniversityofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China; 2.ResearchandInnovationTeamforKeyTechnologyofIntegratedProcessingandPreparationofChineseMedicinalDecoctionPiecesinProducingArea,AnhuiHefei230012,China; 3.InstituteofPharmaceuticalChemistry,AnhuiAcademyofChineseMedicine,AnhuiHefei230012,China)

ObjectiveTo investigate the influence of enzyme on total flavonoids in Chrysanthemum morifolium Ramat. from Bozhou during the drying process, and to provide a basis for preliminary studies on the processing and preparation technology for Chrysanthemum morifolium Ramat. from Bozhou in its producing area. MethodsThe drying process for Chrysanthemum morifolium Ramat. from Bozhou was simulated. The β-D-glucosidase was used for enzymolysis of total flavonoids in Chrysanthemum morifolium Ramat. from Bozhou. The content of three flavonoid aglycones, i.e., acacetin, apigenin, and luteolin, was used as indices to analyze the influence of enzymolysis on the content of these three flavonoid aglycones. ResultsAfter enzymolysis, there were increases in the content of acacetin, apigenin, and luteolin in total flavonoids in Chrysanthemum morifolium Ramat. from Bozhou. ConclusionThe β-D-glucosidase is involved in the enzymolysis of flavonoids in Chrysanthemum morifolium Ramat. from Bozhou and can increase the content of flavonoid aglycones. Hydrolysis of total flavonoids in Chrysanthemum morifolium Ramat. from Bozhou by β-D-glucosidase is one of the reasons for the increased content of flavonoid aglycones during the drying process.

β-D-glucosidase; Chrysanthemum morifolium Ramat. from Bozhou; Flavone

国家自然科学基金青年项目(81303229)；安徽省自然科学基金项目(1408085MH20);安徽省科技攻关项目(1301042100)

闫攀(1989-)，男，硕士研究生

张伟，zhangwei05515125@163.com

R284[DOI]10.3969/j.issn.2095-7246.2016.05.024

2016-03-16；编辑：张倩)