貉产肠毒素型大肠杆菌的分离鉴定

马增晖　阚秋霞　河北省迁安市农业畜牧水产局064400

貉产肠毒素型大肠杆菌的分离鉴定

马增晖阚秋霞河北省迁安市农业畜牧水产局064400

大肠埃希菌（E.coli），俗称大肠杆菌，存在于人和动物肠道内。某些血清型可导致腹泻，称为致病性大肠杆菌，产肠毒素型大肠杆菌（enterotoxigenic E.coli，ETEC）便是其中一种。据报道，ETEC在腹泻病例中的检出率为20％～70％。

ETEC是导致人畜腹泻的主要致病菌。病原性大肠杆菌一般以O抗原进行分型。到目前为止，国内外学者已经从不同种类的动物中分离出几十种血清型的大肠杆菌，然而关于貉产肠毒素型大肠杆菌的研究则很少报道。

大肠杆菌是条件性致病菌，某些血清型可引起貉腹泻。饲养管理不当，饲料品质差，阴雨连绵，饮用脏水等都可提高腹泻的发病率和貉的死亡率，给养貉业造成较大的经济损失。为探讨分离菌的致病性和与貉腹泻死亡的关系，从理论上揭示发病机理，以及有效地指导临床防治，特从迁安某养殖场送检的病死貉体内分离出3株产肠毒素型大肠杆菌并对其生物学特性进行初步探讨，取得了满意的结果。现将结果报告如下。

1　材料

（1）被检材料。被检材料来源于迁安县某养殖场送检的发病貉。

（2）培养基及试剂。普通营养琼脂、7％绵羊鲜血琼脂培养基、麦康凯琼脂、CAYE-2培养液、伊红美蓝琼脂、营养肉汤培养基及生化鉴定用试剂按常规方法配制。

（3）微量糖发酵管及药敏纸片。微量发酵管由上海医学化验所试剂厂生产，批号：20030802。药敏纸片由北京天坛药物生物技术开发公司生产，批号：20040314。

（4）药品及仪器。剪刀、手术刀、酒精、托盘、培养基平板、接种环、试管、温箱和高压灭菌器等均由本单位实验室提供。

（5）试验动物。用于毒素型鉴定动物是体重2kg的兔；用于致病性试验的动物是20日龄健康小白鼠和体重2kg的兔。以上动物均购于迁安某养殖场。

2　方法

（1）发病情况。据养殖户介绍，40多只母貉中2只产出的18只仔貉，有14只发病，其中5只死亡，发病率为78％，死亡率为28％。

（2）临床症状。10～40日龄仔貉易感，食欲废绝，精神极度沉郁，急性型无明显临床症状，突然死亡，部分仔貉下痢，体温不高。无菌采取肠系膜淋巴结、肝脏和脾脏供分离培养用。

（3）病理变化。对病死貉进行剖检，可见脾出血，淤血，肿大；肝出血，淤血，肿大；肾淤血，表面有少量针尖大的坏死灶，肠道膨胀，内有多量积液，肠系膜淋巴结有出血点，肿胀。

（4）病原菌分离培养。无菌操作取腹泻死亡貉心血、肠系膜淋巴结、肝、脾等分别接种于普通营养琼脂、7％绵羊鲜血琼脂培养基、麦康凯琼脂、伊红美蓝琼脂和营养肉汤培养基，37℃培养24～48小时，观察细菌生长情况及菌落特征。选取呈优势生长的菌落接种于普通营养琼脂斜面，37℃培养24小时形成纯培养物，保存，供进一步鉴定用。

（5）细菌形态观察。无菌采取肠系膜淋巴结、肝脏、脾脏直接触片，以及分离菌纯培养物涂片后，革兰氏染色，光学显微镜观察。同时采用节思明氏荚膜染色法和复红美蓝芽孢染色法进行荚膜、芽孢检查。

（6）细菌生化试验。取上述3株纯培养物接种于营养肉汤，37℃培养48小时，按常规方法接种进行生化反应测定。接种于5％半固体高层营养琼脂培养基做运动力检查。

（7）毒素型鉴定。采用兔回肠结扎试验，兔预先饥饿48小时，CAYE-2培养滤液于每个回肠段注射1mL，同时设置未接种细菌的CAYE-2培养滤液作为阴性对照。18小时后处死兔取出结扎肠段，测定每个肠段的长度和液体潴积量。以每厘米肠段内蓄液量≥1mL者为阳性反应，表示被检菌能产生热敏肠毒素LT。

（8）药敏试验。按常规抗菌药物敏感纸片法对分离菌进行药敏试验。取以上3株纯培养后菌体均匀涂片于普通琼脂培养基，稍干后将待测抗菌药物敏感纸片按梅花形粘贴于合适的位置上，37℃温箱中培养48小时，测定抑菌圈直径，并判定其抗菌药物敏感性。判断标准：以抑菌圈直径小于10mm为耐药、11～15mm为中度敏感、16mm以上为高度敏感。

（9）致病性试验。取上述3株纯培养物接种于普通营养肉汤，37℃培养48小时，按0.2mL/只（每mL约含109CFU）腹腔接种于20日龄健康小白鼠，同时按1mL/只（每mL约含109CFU）肌肉接种兔进行致病作用检查，用相同剂量无菌普通营养肉汤和相同途径分别接种20日龄健康小白鼠、兔作为对照，接种后隔离饲养观察72小时，以发病或死亡作为感染与否的判定指标，及时剖解观察病死动物，并从肝、脾、肠系膜淋巴结、心血中分离回收攻毒菌。

2　结果

（1）细菌形态特征。细菌涂片，革兰氏染色后镜检，可见大量革兰氏阴性杆菌，其分离菌形态一致，菌体两端着色较深，中等大小，多数单个存在，无芽孢，有微荚膜，有鞭毛，能运动，短小、两端钝圆，个别呈短链状排列。

（2）细菌培养特性。镜检为阴性的分离菌经37℃培养24～48小时在普通琼脂平板上形成圆形、光滑湿润、隆起、边缘整齐、半透明的淡灰白色菌落，直径2～3mm，在绵羊血平板上呈β溶血。在麦康凯平板上形成红色菌落，在伊红美蓝琼脂上则形成中心黑色并有金属光泽的菌落。营养肉汤中培养物混浊，形成菌环。

（3）分离菌运动性及生化特性鉴定。半固体培养基中，37℃恒温箱培养24小时，细菌沿穿刺线扩散生长，表明分离菌有运动性。上述3株菌培养所表现的生化特性基本一致，进行糖发酵试验，葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、鼠李糖产酸产气，蔗糖试验阳性。甲基红和靛基质试验阳性。V.P试验和柠檬酸盐利用试验均为阴性。还原硝酸盐。不分解尿素。赖氨酸试验阳性，不液化明胶，接触酶试验阳性。结果见表1。

表1　生化特性鉴定结果

（4）毒素型鉴定。试验组共注射三个肠段，均潴积大量的液体，经测定每厘米肠段内蓄液量平均为1.2mL，阴性对照平均为0.6mL，证明被检菌能产生热敏肠毒素。

（5）抗菌药物敏感试验。采用常规纸片法对上述3株分离菌进行了药物敏感性测定，结果所表现的敏感性基本一致，均对恩诺沙星、环丙沙星、阿莫西林、羧苄青霉素和氟哌酸高度敏感，对丁胺卡那霉素中度敏感，对先锋霉素、链霉素、四环素和土霉素表现出耐药性。结果见表2。

（6）致病性。上述3株分离菌株对小白鼠和兔的致病性试验结果见表3。从表3中可以看出，3株分离菌株腹腔接种小白鼠和肌肉接种兔均具有高致病性，致死率均为100％。注射肉汤培养物的小白鼠和兔于72小时死亡，死后剖检，肝脏、脾脏、肾脏肿大色暗红，质地变脆，肠膨胀。内脏涂片，革兰氏染色，可见大量革兰氏阴性中等大小之杆菌，与从病死貉分离的细菌是完全一致的。而对照组小白鼠和兔则全部健康存活。经培养和生化特性鉴定与接种菌相一致。证明所分离菌为产毒素型大肠杆菌。结果见表3。

表2　抗菌药物敏感试验结果

表3　致病性试验结果

3　小结

（1）根据细菌发病情况、临床症状、剖检变化，结合分离菌形态特征、培养特性、生化特性、致病性，以及肠毒素测定，确定所分离的细菌为能产生热敏肠毒素（LT）的产肠毒素型大肠杆菌。

（2）研究资料表明，消化道是产肠毒素型大肠杆菌（ETEC）侵入机体的主要途径，而产肠毒素型大肠杆菌主要通过菌体表面的一种对宿主有特异性的粘附因子粘附到小肠黏膜表面并不断繁殖，分泌肠毒素，引起肠黏膜细胞水与电解质代谢紊乱，导致腹泻。目前常见的粘附因子有CFA/Ⅰ，CFA/Ⅱ，K88，K99，987P和F41等。ETEC可产生两种肠毒素，即耐热性肠毒素（ST）和热敏性肠毒素（LT）。肠毒素试验结果表明，我们所分离的菌株能产生LT毒素，而与K88，K99，987P单因子血清不发生反应，说明肠毒素是导致仔貉腹泻死亡的直接原因。ETEC粘附因子、肠毒素与其致病性三者之间存在一定的相关关系，粘附因子具有很强的表面粘附能力，是ETEC致病的基础，肠毒素是ETEC致病的主要原因。但如果ETEC失去表达粘附因子的能力，那么ETEC进入小肠也不会引起腹泻。试验结果表明，所分离的菌株可产生LT毒素，在营养肉汤中培养48小时可表达丰富的菌毛，同时对小白鼠和兔均具有很高的致病性。从表3中可以看出，所分离的菌株腹腔接种小白鼠和肌肉接种兔均具有高致病性，致死率均为100％。

（3）随着抗菌药物在生产中大量和不规范的使用，使得抗菌药物耐药菌株不断增多，在生产中若不进行药敏试验来指导用药，极易影响药物的治疗效果，造成经济损失。药敏测试结果表明，病菌均对恩诺沙星、环丙沙星、阿莫西林、羧苄青霉素、氟哌酸高度敏感，对丁胺卡那霉素中度敏感，对先锋霉素、链霉素、四环素、土霉素表现出耐药性。选用高度敏感的恩诺沙星、环丙沙星、阿莫西林应用于治疗，收到了较好的效果，在生产中可考虑优先使用。