胎儿安颗粒对ACA阳性孕鼠胎盘形态学及血浆NO含量的影响

敬娟广元市妇幼保健院628000四川广元市蜀门北路545号肖新春陕西中医药大学712021

·实验研究·

胎儿安颗粒对ACA阳性孕鼠胎盘形态学及血浆NO含量的影响

敬娟广元市妇幼保健院628000四川广元市蜀门北路545号
肖新春*陕西中医药大学712021

目的：观察胎儿安颗粒对抗心磷脂抗体（ACA）阳性孕鼠胎盘形态学及血浆中一氧化氮（NO）含量的影响，探究胎儿安颗粒治疗ACA阳性所致免疫性流产的作用机理。方法：动物适应性喂养3天后，随机分为空白组、模型组、阿司匹林组、胎儿安低剂量组、胎儿安中剂量组、胎儿安高剂量组，每组10只。每日晨8：00行阴道脱落细胞检查，建立大鼠动情周期档案；于喂养8 d、12 d，除空白组外，其他各组雌鼠均注射ACA蛋白液建立ACA阳性孕鼠模型；于第2次注射ACA蛋白液24 h后，用ELISA法检测抗体滴度；将雌雄大鼠2∶1合笼，发现阴栓或者阴道涂片中可见大量精虫标记为妊娠第1天，从妊娠第1天开始给药，1次/天，共14 d。结果：光镜下胎盘组织形态学检查发现，模型组胎盘存在不同程度滋养细胞变性，甚至坏死，可见胎盘免疫复合物沉积及大量炎性细胞浸润，胎盘血管扩张；治疗各组孕鼠的胎盘组织免疫复合物沉积均有不同程度的减少，胎盘血管扩张及静脉瘀血现象减少。NO含量测定结果显示，与空白组比较，模型组NO含量明显降低（P＜0.05）；与模型组比较，其他治疗各组NO含量均升高（P＜0.05或P＜0.01）；与阿司匹林组比较，胎儿安中、高剂量组NO含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与胎儿安低剂量组比较，胎儿安中、高剂量组的NO含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；而胎儿安中、高剂量组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论：胎儿安颗粒能增加血浆中NO含量，减少胎盘免疫复合物的沉积和胎盘血栓的形成，增强胎盘血流灌注，提示此为其治疗ACA阳性所致免疫性流产的作用机理之一。

胎儿安颗粒；ACA阳性；胎盘形态学；NO

在引起流产的诸多因素中，除环境、内分泌、解剖、生殖道感染等以外，免疫因素是造成流产的一个重要因素，20%～60%的习惯性流产与抗心磷脂抗体（ACA）阳性有关［1］。如何积极防治自然流产已经成为临床医学研究的重要课题。ACA阳性所致的流产，属于免疫性流产范畴，其临床主要表现为妊娠早期阴道流血、腹痛或腰酸等［2］。目前，对于ACA阳性所致的流产多采用西医治疗，但由于药物的副作用大，并未得到广泛认可和使用。胎儿安颗粒为陕西中医药大学第一附属医院的院内制剂，由菟丝子、杜仲、川续断、黄芪、白芍、丹参、川芎、苏梗等8味中药组成，具有补肾安胎、活血化瘀功效，临床上治疗ACA阳性所致的流产疗效显著。本实验通过建立ACA阳性孕鼠的模型，观察胎儿安颗粒对ACA阳性孕鼠胎盘形态学及血浆中一氧化氮（NO）含量的影响，探究胎儿安颗粒治疗ACA阳性所致免疫性流产的作用机理。现报道如下。

1　实验材料

1.1动物SPF级雌性SD大鼠60只，未经交配生育，体重约180～220 g；SPF级雄性SD大鼠30只，体重约180～220 g；均购自西安交通大学医学部实验动物中心，合格证号：SCXK（陕）2012-003。

1.2药物与试剂胎儿安颗粒（每袋10 g），由陕西中医药大学第一附属医院制剂室提供；阿司匹林肠溶片（每片25 mg，陕西白鹿制药股份有限公司，批号：61023177）。一氧化氮测试盒（南京建成生物工程研究所）；ACA免疫分析盒（南京建成生物工程研究所提供及ELISA试剂盒）。

1.3仪器离心机（LXJ-2型，上海医用分析仪器厂）；酶标仪（ELx 808型，上海医用分析仪器厂）；电子显微镜（CP62-JSM，北京中西远大科技有限公司）；切片机（上海徕卡仪器有限公司）。

1.4 ACA蛋白液的来源及提纯

1.4.1 ACA阳性血清的收集选择2014年9月～2015年4月于陕西中医药大学第一附属医院门诊或住院就诊、经ELISA检测ACA呈阳性的患者，经本人同意后留存血清。排除合并其他疾病者，如器质性心脏病、肝肾功能严重损坏、精神疾病等。

1.4.2 ACA蛋白溶液的提纯及浓度的测定由陕西中医药大学第一附属医院检验科完成。初步经过2次盐析法，得到提纯后的蛋白溶液，在280 nm下测定其OD值，根据公式求得溶液中蛋白质浓度（g/L）=1.2×OD280nm［3］。将蛋白液的浓度配成15 mg/m l，于-20℃分装保存。

2　实验方法

2.1动物模型制备与给药根据卫爱武等［4］的方法建立ACA阳性孕鼠动物模型。具体步骤如下：适应性喂养3天后，将60只未孕的雌性大鼠，随机分为空白组、模型组、阿司匹林组、胎儿安低剂量组、胎儿安中剂量组、胎儿安高剂量组，每组10只。每日行阴道脱落细胞涂片，建立大鼠动情周期档案；于喂养第8 d、12 d，除空白组外，其他各组雌鼠均在背部多部位皮下注射纯化的ACA蛋白液75mg/（kg·d）；第2次注射ACA蛋白液24 h后，尾静脉取血，用ELISA法检测抗体滴度，结果雌鼠血中ACA-IgM抗体呈阳性，验证ACA阳性雌鼠造模成功。将雌雄大鼠2∶1合笼，发现阴栓或者阴道涂片中可见大量精虫标记为妊娠第1天［4］，从妊娠第1天开始给药，1次/天，共14天。大鼠用药剂量按施氏法［5］计算每日大鼠的等效剂量。具体用药如下：空白组予自由饮水，连续14天。模型组每只动物灌胃给予2m l生理盐水，1次/天，连续14天。阿司匹林组予18.75mg/kg阿司匹林混悬液灌胃，1次/天，连续14天，约等于大鼠每日临床剂量。胎儿安低剂量组予1.562 g/kg胎儿安颗粒混悬液灌胃，1次/天，连续14天，约等于大鼠每日剂量1/2倍。胎儿安中剂量组予3.125 g/kg，胎儿安颗粒混悬液灌胃，1次/天，连续14天，约等于大鼠每日剂量。胎儿安高剂量组予6.250 g/kg胎儿安颗粒混悬液灌胃，1次/天，连续14天，约等于大鼠每日剂量的2倍。

2.2标本的采集动物予4 m l/kg 10%水合氯醛腹腔注射麻醉，待麻醉成功后，将其固定在小动物手术台上，纵切口依次切开皮肤、进入腹腔，暴露手术视野，可见孕鼠为双角子宫，单侧一角子宫可孕育大小不等的胚胎组织，用止血钳夹住一侧子宫末端，并切断，分离相邻的胚胎组织，称重，然后用眼科镊子小心剥离胎盘，吸净血迹，将完整胎盘组织放置于10%的甲醛溶液中固定，沿着胎盘血管垂直取材，常规制片。采集胎盘组织结束后，继续分离周围脏器，用眼科镊子暴露腹主动脉并采血，离心，分离血浆，用于检测血浆中的NO含量。

2.3血浆中NO的含量测定采用硝酸还原酶法。用移液枪头于空白管中加入双蒸水0.1 ml，标准管加入标准应用液0.1 ml（浓度为100μmol/L），测定管内加入60个样本血浆各0.1 m l，分别在各管加入混合试剂0.4 m l，充分混匀后，置37℃水浴锅中温浴60 min。水浴后，在上述各管中分别加入反应试剂，旋涡均匀30 s，在室温下静置40 min后，放入离心机离心，速度为3 500 r/min，离心10 min后取上清液显色。各管中加入上清液0.5m l，在各管中加入显色剂0.6ml，充分混匀后室温静置10 min，设定波长为550 nm，光径为0.5 cm，用酶标仪检测出各管吸光度值，根据吸光度的值可计算出NO含量。计算公式：NO含量（μmol/L）=（测定管吸光度-空白管吸光度）/（标准管吸光度-空白管吸光度）×标准品浓度（100μmol/L）×样品测试前稀释倍数。

3　实验结果

3.1 ACA抗体的检测见表1。与模型组比较，各治疗组的ACA抗体水平差异均有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

表1　 ACA抗体检测比较（s）

表1　 ACA抗体检测比较（s）

注：与模型组比较，①P＜0.05，②P＜0.01

组别ACA-IgM（OD值）空白组--模型组1.339±0.473阿司匹林组0.950±0.236①胎儿安低剂量组1.086±0.958①胎儿安中剂量组0.837±0.387②胎儿安高剂量组0.629±0.754②

图1　各组大鼠胎盘组织形态变化（×200）

3.2各组大鼠胎盘组织形态变化

见图1。空白组：胎盘组织结构清晰，组织细胞排列整齐，血窦丰富，分布均匀。模型组：组织结构不清晰，滋养细胞层存在不同程度组织细胞变性，甚至坏死，周围出现大量炎性细胞浸润，并可见免疫复合物沉积，胎盘血管明显扩张，提示静脉瘀血，血栓形成。阿司匹林组：胎盘组织有明显免疫复合物沉积，滋养细胞层少量细胞变性、坏死，周围可见炎性细胞浸润，胎盘血管扩张现象改善。胎儿安低剂量组：胎盘组织内免疫复合物沉积减少，少量细胞组织变性坏死，胎盘血管扩张，静脉瘀血现象未见明显改善。胎儿安中剂量组：胎盘组织结构清晰，偶见组织细胞变性坏死，免疫复合物沉积明显减少，偶见胎盘血管扩张及静脉瘀血。胎儿安高剂量组：胎盘组织结构清晰，偶见胎盘血管扩张及静脉瘀血，胎盘形态趋于正常。结果显示，治疗各组孕鼠的胎盘组织免疫复合物沉积均有不同程度的减少，胎盘血管扩张及静脉瘀血现象减少；与胎儿安低剂量组比较，阿司匹林组的胎盘血管扩张及静脉瘀血现象减轻，但对免疫复合物沉积的减少不及胎儿安低剂量组。

表2　各组孕鼠一氧化氮（NO）含量比较（±s）

表2　各组孕鼠一氧化氮（NO）含量比较（±s）

注：与空白组比较，①P＜0.05；与模型组比较，②P＜0.05；与阿司匹林组比较，③P＜0.05；与胎儿安低剂量组比较，④P＜0.05

组别n NO（pg/m l）空白组10 37.218±2.209模型组10 29.945±2.006①阿司匹林组10 33.551±2.537②胎儿安低剂量组10 34.304±1.809②胎儿安中剂量组10 35.355±2.185②③④胎儿安高剂量组10 36.472±1.920②③④

3.3硝酸还原酶法测定NO含量结果见表2。表2显示，与空白组比较，模型组NO含量明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，其他治疗各组NO含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与阿司匹林组比较，胎儿安中、高剂量组NO含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与胎儿安低剂量组比较，胎儿安中、高剂量组的NO含量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），但胎儿安中、高剂量组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

4　讨论

胎盘是胚胎与母体组织的结合体，是联系胎儿和母体进行物质交换的重要器官，因此胎盘血流丰富，血管互联成网形成血窦。各类危害妊娠的疾病以及各种危害因素如烟、酒刺激等都会影响到胎盘的生理功能。NO是血管内皮释放的重要舒张血管物质，其作用为调节舒张血管张力，有效抑制血小板聚集，抗血栓，抑制血管内皮中中性粒细胞和单核细胞聚集和粘附。同时NO也是体内重要的调节分子，主要作用为调节EC（内皮细胞）、SMC（平滑肌细胞）、神经细胞等，传递神经信息，抑制血小板聚集，扩张血管维持正常。在ACA阳性所致流产的病理状态下，胎盘血管内皮受损，影响NO的释放，血浆中NO含量降低，NO不能发挥正常舒张血管、调节血管张力的作用，血小板大量聚集，微血栓形成。反之，如血浆中NO含量增高，能有效抑制血小板聚集以及维持妊娠胎盘血流高灌低阻状态［6］。

通过在光镜下观察胎盘组织，证实了胎儿安颗粒能够减少组织细胞变性、坏死，减少炎细胞浸润及免疫复合物沉积，减少胎盘血管扩张及静脉瘀血，同时增加了血流灌注，其中以胎儿安中、高剂量组最为明显。对比阿司匹林组与胎儿安低剂量组发现，阿司匹林组的胎盘血管扩张及静脉瘀血现象减轻，但改善胎盘内免疫复合物沉积的情况却不及胎儿安低剂量组，提示胎儿安颗粒对于减少免疫复合物沉积的作用优于阿司匹林。

与模型组比较，胎儿安各剂量组均能使NO在血浆中的含量增高，说明胎儿安颗粒组能通过调节NO水平，增高血浆中NO含量，抑制血小板聚集，减少血栓形成，增加血流灌注。

胎儿安颗粒是以寿胎丸为基础方进行加减的纯中药复方制剂，由菟丝子、杜仲、川续断、黄芪、白芍、丹参、川芎、苏梗等8味中药组成，主要依据“凡出血，必有瘀血”“血以流为贵，以滞为患”“瘀血不去，新血不得归经”等理论组方而成。方中菟丝子味辛，性甘平，具有补肾益精、固冲任安胎功效，既补肾阴又补肾阳，为平补阴阳之良药；川续断味苦，性微温，具有补益肝肾、安胎的功效，与菟丝子相配伍为君药，更能发挥补肾安胎的作用。丹参、川芎、黄芪共为臣药，丹参味苦性寒，为妇科调经要药，功擅祛瘀生新，古有“丹参有孕能安，死胎可落”之说；川芎性味辛温，活血行气，祛瘀止痛，为血中之气药，具有通达气血之功效，其与丹参二药相配，活血化瘀安胎；黄芪味甘，性微温，为补气要药，具有健脾补中、升举阳气、维系胞脉的功效。杜仲、白芍为佐药，杜仲味甘，性温，具有补肝肾、强筋骨、安胎的功效；白芍味苦酸微寒，亦为补血药，既可敛阴柔肝养血，又可理气缓急止痛，与杜仲相配为佐药，更能发挥柔肝补肾、养血安胎的作用。苏梗味辛甘，为使药，能理气安胎。诸药配伍共奏补肾安胎、活血化瘀作用。

［1］罗秋燕，杨宗孟.中药治疗抗心磷脂抗体所致流产的疗效观察［J］.长春中医学院学报，2004，20（4）：9.

［2］陆启滨.抗心磷脂抗体阳性的病因病机探析［J］.中华中医药学刊，2008，26（6）：1127-1128.

［3］Ed Harlow，David Lane.抗体技术实验指南［M］.北京：科学出版社，2002：9.

［4］卫爱武，宋艳丽.异种抗磷脂抗体皮下注射致妊娠丢失大鼠模型的改良［J］.郑州大学学报，2009，44（3）：525-529.

［5］施新猷.医用实验动物学［M］.西安：陕西科学技术出版社，2002：352.

［6］孟会.血小板生长因子及一氧化氮与妊高征胎盘血管病变［J］.国外医学：妇产科学分册，2002，29（6）：331-333.

（2016-06-28收稿/编辑陈明伟）

The Effect of Fetus-Protecting Granules on Placenta Morphology and No Content in Plasm a of ACA Positive Pregnant Rat

Jing Juan Guangyuanmaternal and child health hospital，628000 No.545，ShumenbeiRoad，Guangyuan city，Sichuan Xiao Xinchun Shanxi University of Traditional Chinese Medicine，712021

Objective：To observe the effectof fetus-protecting granules on placentamorphology and nitric oxide（NO）content in plasma of anti cardiolipin antibody（ACA）positive pregnant rat and explore the treatmentmechanism for ACA-induced immune abortion through the establishment of ACA positive pregnant ratmodel.M ethods：The ratswere random ly divided into blank group，model group，aspirin group，fetus-protecting granules of low，middle and high dose groups three days later after adaptive feeding（Ten rats for each group）.The vaginal cytology testwas conducted so as to establish archives on rats oestrous cycleat 8：00 in the morning every day.Female rats of all groups except for blank group was injected with ACA protein liquid 8days and 12 days later after feeding.ELISA method was used to detect antibody titer 24 hours later after injection with ACA protein liquid for the second time. The male and female rats were cohabitated at the ratio of 2∶1.A large number of sperm marks could be seen in vaginal plug or vaginal smear on the first day of gestation.Administration had lasted for 14 days since the first day of gestation（once for each day）.Result：Microscopic examination of the placentalmorphology showed that the placenta of themodel group had varying degrees of trophoblastic degenerationand even necrosis，with placental immune complex deposition，a large number of inflammatory cells infiltration and placental vasodilation.Placental immunecomplex deposition were reduced to varying degrees with less placental vasodilation and venous congestion.It was suggested that there were different degrees of curative effects on treatment group.NO content of themodel group was significantly lower than that of the blank group（P＜0.05）.Compared with model group，the content of NO in treatmentgroups had increased significantly（P＜0.05 or P＜0.01）.Compared with aspirin group，the contentof NO in fetus-protecting granules ofmiddle and high dose groups had increased significantly（P＜0.05）.Compared with fetusprotecting granules of low dose group，the content of NO in middle and high dose groups had increased significantly（P＜0.05）.No significant difference was found between fetus-protecting granules ofmiddle dose group and high dose group（P＞0.05）.Conclusion：The fetus-protecting granules can increase the NO content in plasma，reduce placental immune complex deposition and formation of placental thrombosis，and enhance placental perfusion.It could be one of the functionalmechanisms for treatmentof ACA-induced immune abortion.

fetus-protecting granules；anti cardiolipin antibody（ACA）positive；placentamorphology；NO

R285.5

A

1003-0719（2016）05-0065-04

，副教授；E-mail：2364258209@qq.com