鸡α干扰素的原核表达及纯化

吴斯宇，孙超，崔进，冯赛祥，黄健妮，王念晨，曲楠楠，廖明，焦培荣

（1.华南农业大学兽医学院人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室农业部兽用疫苗创制重点实验室广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州510642；2.君拓价值投资公司，美国新泽西州08542；3.北京利昂盛生物技术有限公司，北京海淀100094）

鸡α干扰素的原核表达及纯化

吴斯宇1，孙超2，3，崔进1，冯赛祥1，黄健妮1，王念晨1，曲楠楠1，廖明1，焦培荣1

（1.华南农业大学兽医学院人兽共患病防控制剂国家地方联合工程实验室农业部兽用疫苗创制重点实验室广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室，广东广州510642；2.君拓价值投资公司，美国新泽西州08542；3.北京利昂盛生物技术有限公司，北京海淀100094）

根据大肠杆菌密码子的偏好性对GenBank中发表的鸡α干扰素基因序列进行了密码子优化，全基因合成了鸡α干扰素基因片段486 bp。构建原核表达质粒pET-23b-ChIFN-α。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），用IPTG进行诱导表达，表达产物主要以包涵体形式存在，包涵体进行变性、复性和镍柱亲和纯化。表达产物经SDS-PAGE、Western-Blot分析表明，ChIFN-α蛋白得到了高效表达，其蛋白分子质量约19 kD，经镍柱亲和纯化后获得了高纯度的重组鸡α干扰素蛋白，其含量为0.82 mg/mL。本研究为鸡α干扰素的生物学活性分析和临床产品研发奠定了基础。

鸡α干扰素；原核表达；蛋白纯化

根据大肠杆菌密码子的偏好性对GenBank中发表的鸡α干扰素基因序列进行密码子优化，人工合成该鸡干扰素基因。接着成功构建了鸡α干扰素的原核表达质粒，经原核表达后获得了鸡α干扰素的重组蛋白。表达产物经SDS-PAGE、Western-Blot分析表明，本研究获得了重组干扰素的高效表达，其蛋白分子质量约19 kD，经镍柱亲和纯化后获得了高纯度的重组鸡α干扰素蛋白，其含量约为0.82 mg/mL。这为鸡α干扰素的生物活性分析与临床开发应用奠定了基础。

1材料与方法

1.1菌种E.coli/DH5α、BL21（DE3）由华南农业大学兽医学院动物传染病实验室保存。

1.2质粒及相关酶pET-23b由华南农业大学兽医学院动物传染病实验室保存。限制酶EcoRI、NdeI及T4 DNA连接酶等，购自宝生物工程（大连）有限公司；DNA片段快速回收试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.3鸡α干扰素基因的克隆及密码子的优化根据大肠杆菌密码子的偏好性对GenBank中发表的鸡α干扰素基因序列（AB021154）进行了密码子优化，人工合成该鸡α干扰素基因。优化后的基因由英潍捷基（上海）贸易有限公司合成。

引物设计：根据密码子优化后的鸡α干扰素基因，利用Primer5.0软件设计1对特异性的引物。

ChIFN-α-F：5′-TATATACATATGTGCAACCATCTGCGCCCG-3′，

ChIFN-α-R：5′-TATATAGAATTCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGGTGCGGGTGTTGCCGG-3′。

1.4重组表达质粒的构建以人工合成的鸡α干扰素基因为模板，以含NdeI酶切位点的ChIFN-α-F和含EcoRI酶切位点、His标签的ChIFN-α-R的引物，鸡α干扰素基因PCR产物经NdeI、EcoRI双酶切克隆到原核表达载体pET-23b。重组阳性质粒送英潍捷基（上海）贸易有限公司测序鉴定。

1.5鸡α干扰素基因在大肠杆菌中的表达将测序正确的pET-23b-ChIFN-α重组质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，经氨苄青霉素抗性平板筛选、NdeI、EcoRI双酶切鉴定，进一步验证该重组阳性质粒。将再次鉴定的pET-23b-ChIFN-α-BL21（DE3）接种于液体LB培养基，37℃震荡培养。OD值为0.6时，培养物中加终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达。继续培养4 h之后，离心收集菌体，通过SDS-PAGE方法分析目的蛋白的表达情况。

1.6鸡α干扰素蛋白的纯化

1.6.1包涵体的提取与处理将1L诱导表达的重组菌E.coli/pET-23b-ChIFN-α以10 000 r/min离心收集菌体，按1∶5的菌体超声缓冲液（50 mmol/ L Tris，0.5 mmol/L EDTA，50 mmol/L NaCl，pH值7.0）重悬菌体，在冰浴的条件下，充分超声破碎，然后于10 000 r/min（4℃）离心15 min收集沉淀（沉淀即为粗制包涵体）。

1.6.2包涵体的变性按1∶5的包涵体变性液比例将洗涤后的包涵体溶解于8 mol/L尿素的变性液中（50 mmol/L Tris-HCl，8 mol/L Uera，5 mmol/L DTT，pH值8.0）。室温磁力搅拌6 h，然后以12 000 r/min（4℃）离心20 min，收集变性液上清，4℃保存。

1.6.3包涵体的复性采取梯度稀释法进行蛋白复性，复性时采用滴管悬滴，分3次把变性液加入到预冷的复性液（50 mmol/L Tris-HCl，0.15 M Na-Cl，0.3 mol/L L-Arg，1 mM GSSG，5 mmol/L GSH， 10%甘油，pH值7.0）中，使变性液与复性液的比例达到1∶20。完成后转入4℃冰箱，静置复性24 h。

1.6.4镍柱亲和纯化复性完成后，复性液经透析除去L-Arg，参照QIAGEN公司镍柱纯化说明书纯化His标签的目的蛋白进行。

1.6.5SDS-PAGE、Western-Blot检测结果将SDS-PAGE凝胶上的蛋白转印至硝酸纤维素膜（NC），用His标签抗体（1∶2 000）作为一抗，用辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠（1∶10 000）作二抗，Western-Blot检测目的蛋白。

2结果

2.1重组鸡α干扰素表达质粒的构建挑取5个克隆进行菌落PCR筛选，菌落PCR筛选结果为阳性的质粒送英潍捷基公司测序鉴定。测序结果与优化的鸡α干扰素的序列比对分析，表明成功构建重组鸡α干扰素原核表达质粒。

图1菌落PCR检测

2.2重组鸡α干扰素的诱导表达结果用IPTG对含有原核表达质粒pET-23b-ChIFN-α的BL21表达菌株进行诱导，诱导后的菌液经12%SDS-PAGE分析，结果显示，表达的重组鸡α干扰素蛋白的分子质量约19 kD，与预期结果相符，证明重组鸡α干扰素表达正确。

图2蛋白表达的SDS-PAGE检测

图3表达产物复性及纯化的SDS-PAGE检测

2.3重组鸡α干扰素的复性、纯化结果表达产物经过变性复性、透析、镍柱亲和纯化后，对样品进行SDS-PAGE分析，结果显示，纯化产物纯度较高，蛋白浓度达0.82 mg/mL。

2.4重组鸡α干扰素蛋白纯化后Western-Blot验证重组鸡α干扰素蛋白经Western-Blot检测在19 kD处出现目的条带，表明表达产物为目的蛋白（如图4）。

图4鸡α干扰素Western-Blot检测

3讨论

近年来我国养禽业发展迅速，规模不断扩大。但是，禽流感、鸡新城疫，鸡传染性支气管炎等病毒类疾病的流行制约了养禽业发展的重要因素。目前我国仍然采用疫苗免疫、化学药物及抗生素治疗等方法来防制禽类疾病。但由于病原的血清型复杂、变异速度快，常常导致疫苗的免疫效果不佳，同时抗生素和化学药物的使用又因为病原的耐药性与药物残留问题而限制了其使用的范围。家禽干扰素具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用，干扰素是由英国病毒生物学家Isaacs等于1957年在鸡上发现并被命名的，1994年Sekellick等首次成功克隆和表达了鸡α干扰素（chicken interferon-alpha，ChIFN-α）基因［1-2］。近年来国内外学者对禽干扰素的表达与抗病毒活性进行了研究。何静等将鸡α干扰素与白介素-18融合表达，获得了具有抗新城疫病毒的重组干扰素蛋白［3］。戴华等通过原核表达获得了在鸡胚上具有抗高致病性禽流感H5N1的重组α干扰素蛋白［4］。龚浪等通过基因工程的方法获得含有鸡α干扰素的真核表达质粒［5］。蔡梅红等通过酵母的表达系统获得了具有抗马立克病病毒和新城疫病毒的重组α干扰素，也通过大肠杆菌原核表达的方法获得了具有抗传染性支气管炎病毒的重组鸡β干扰素［6-7］。Reuter等人则是证明了鸡λ干扰素具有抗病毒作用［8］。

本研究根据大肠杆菌密码子的偏好性对Gen-Bank中发表的鸡α干扰素基因序列进行了密码子优化，人工合成该序列。构建了干扰素重组表达质粒pET-23b-IFN-α，经原核表达后获得了鸡α干扰素的重组蛋白。诱导、纯化产物经SDSPAGE，Western-Blot验证，结果显示，pET-23b-IFN-α在大肠杆菌中表达良好，纯化效果良好。本研究为鸡干扰素生物学活性分析的研究及临床开发应用的研制奠定了基础。

［1］Isaacs A，Lindenmann J.Virus interference I.The interferon［J］. Proc R Soc Lond B Biol Sci，1957，147（927）：258-267.

［2］Sekellick M J，Ferranno A F，Hopkins D A，et al.Chicken interferon gene：cloning，expression，and analysis［J］.Interferon Res，1994，14（2）：71-79.

［3］何静，张盼盼，孙敏华，等.鸡α干扰素/白细胞介素18基因的融合表达及抗病毒活性研究［J］.华南农业大学学报，2015，36（01）：18-22.

［4］戴华，郑佳玉，陈俊华，等.α干扰素基因的原核表达及其活性测定［J］.中国预防兽医学报，2009，31（10）：804-807.

［5］龚浪，林宏文，崔进，等.鸡α干扰素基因真核表达载体pCAGGS-IFN-α的构建及其在293 T细胞中的表达［J］.黑龙江畜牧兽医，2014（15）：21-23+27+268.

［6］蔡梅红，曹瑞兵，曹景立，等.重组酵母鸡α干扰素的诱导表达及其抗MDV、NDV能力［J］.西北农林科技大学学报（自然科学版），2010，38（09）：37-41.

［7］Cai Meihong，Zhu Feng，Shen Pingping，et al.Expression and purification of chicken beta interferon and its antivirus immunological activity［J］.Protein Expression and Purification，2012，84（1）：123-129.

［8］Reuter A，Soubles S，Hartle S，et al.Antiviral Activity of Lambda Interferon in Chickens［J］.Journal of Virology，2014，88（5）：2835-2843.

Prokaryotic expression and purification of recombinant chicken interferon-alpha

WU Si-yu1，SUN Chao2，3，
CUI Jin1，FENG Sai-xiang1，HUANG Jian-ni1，WANG Nian-chen1，QU Nan-nan1，LIAO Ming1，JIAO Pei-rong1（1.C
ollege of Veterinary Medicine，National and Regional Joint Engineering Laboratory for Medicament of Zoonosis Prevention and Control，Key Laboratory of Animal Vaccine Development，Ministry of Agriculture，Key Laboratory of Zoonosis Prevention and Control of Guangdong，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China；2.Junto Value Investments，LLC，USA New Jersey，08542；3.Beijing Lioson Biotech Company Limited，Beijing 100094，China）

ChIFN-α gene secquence from Genebank was designed and synthesized based on the synonymous codon bias of E.coli，and GC-content was optimized.The ChIFN-α gene was cloned into prokaryotic expression vector pET-23b and highly expressed in E.coli by 1 mM IPTG induction.Then recombinant protein in form of inclusion body was purified by nickel affinity chromatography after being denatured and re-natured.Analysis of objective protein by SDS-PAGE and Western blot showed that the objective band was 19 kD is clear and confirmed that ChIFN-α was expressed correctly and high purity recombinant ChIFN-α was obtained.This study laid a foundation for the study of biological activities of ChIFN-α.

ChIFN-α；prokaryotic expression；protein purification

s：JIAO Pei-rong；LIAO Ming

S816.75

A

0529-6005（2016）08-0029-03

2016-04-19

科技部国际合作项目（2013DFA31940）；广州市科技计划项目（2013J4500030、201300000037）

吴斯宇（1991-），男，硕士生，研究方向为动物传染病学与免疫学，E-mail：15813365538@163.com

焦培荣，E-mail：prjiao@scau.edu.cn；廖明，E-mail：mliao@scau.edu.cn